嗜根考克氏菌DC2201中双组分信号系统的研究

发布时间：2020-07-17 02:53

【摘要】：双组分信号系统(two-component system,TCS)是细菌感知和响应环境的普遍机制,由组氨酸激酶(histidine kinase,HK)和应答调控蛋白(response regulator,RR)组成,它们能够使机体根据环境条件的改变做出适当的细胞反应。嗜根考克氏菌(Kocuria rhizophila)是一种抗生素活性测试的常用质量控制菌株,但目前有关它的TCS研究尚不多见,仅在DC2201菌株中有报道。本文以嗜根考克氏菌为研究对象,综合采用生物信息学、现代微生物分子生物学的研究方法和技术,研究嗜根考克氏菌的TCSs,具体过程和结果如下:1.通过生物信息学手段对8株序列已知的嗜根考克氏菌菌株的TCSs进行了数量、结构和功能的分析,研究结果显示嗜根考克氏菌中共存在13种TCSs,且HKs和RRs都是模块化蛋白质,参与外界压力应答、细胞壁合成、酶活性、物质代谢与运输等生命活动。2.利用酵母双杂交系统,分别以嗜根考克氏菌HK8700和RR8701为诱饵蛋白和猎物蛋白,构建真核表达载体pGBT9-HK8700和pGAD10-RR8701,通过PEG/LiAc方法先后将载体导入到酵母菌AH109,采用多重氨基酸缺陷培养基筛选,证实了HK8700和RR8701具有相互作用。3.采用PCR的方法特异性扩增嗜根考克氏菌基因hk8700*和rr8701,分别构建原核表达载体pET-29a(+)-HK8700*和pPGH-RR8701,通过添加IPTG诱导、亲和层析柱分离获得大量可溶性蛋白HK8700*和RR8701。纯化的蛋白HK8700*先进行自磷酸化反应,随后与RR8701蛋白混合发生磷酸转移现象,通过甲基绿染色显现丙烯酰胺上磷酸化蛋白,证实了HK8700-RR8701是一对TCS。4.以嗜根考克氏菌的TCS HK8700-RR8701中的应答调控蛋白基因rr8701为目的基因,以温度敏感型质粒pKC1139为载体,扩增获得rr8701上下游片段和质粒pIJ790上的氯霉素基因cat,通过融合PCR的方法获得敲除盒UCD,从而构建rr8701基因敲除载体pKC1139-UCD。以上结果对揭示嗜根考克氏菌双组分信号系统、进而构建该菌的TCS调控网络提供依据;构建的敲除载体pKC1139-UCD为探讨HK8700-RR8701的功能、建立嗜根考克氏菌的遗传转化系统奠定了基础,并可推动其在工业上的应用。
【学位授予单位】：江西师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q93
【图文】：

饼图,古菌,子类,古细菌

图 1-1 RR 超家族的分类[61]Figure 1-1 Classification of the RR superfamily饼图显示了五个 RR 家族在所有分类 RR 中的百分比；子类的进一步分类显示 RR 家族子类的百分比分布如下所示；研究最多的子类的代表成员的结构在了说明。: Pie chart presenting the percentage distribution of the five RR families among alurther classification in subclasses is presented in horizontal bars. The percentage d subclasses within the respective RR family is indicated below. Structures of repbers of the most studied subclasses are illustrated in ribbon diagrams.3 双组分信号系统的分布基因组调查显示 TCSs 存在于三大界：细菌、古细菌和真核生物。以被认为不存在 TCSs[50, 62]，但最近在已完成测序的无胆甾原体基因组多个 HKs 和 RRs（mistdb.com）。此外，约有 50％的古细菌含有 T泉古菌门、初古菌门和纳古菌门中尚未发现。早期的基因组调查表在于后生动物和原生生物中[51]，但是通过 SMART 数据库查询到真液霉菌的 TCSs。

技术路线图,克氏,酵母双杂交系统,硕士学位论文

硕士学位论文细胞活力影响的分子机制仍不清楚，其 TCS 系统也不清楚。本文首先采用生物信息学方法分析嗜根考克氏菌 TCSs 的数量、结然后利用酵母双杂交系统，体外磷酸化分析方法对嗜根考克氏菌中的芽孢杆菌中调控细胞分裂和保持膜完整性的 LiaS-LiaR 具HK8700-RR8701 系统进行验证，同时构建了 rr8701 敲除载体，为下根考克氏菌中 HK8700-RR8701 系统的功能，进而构建嗜根考克氏菌通路提供实验依据。1.4 技术路线实验研究的方法与技术路线如下：

组氨酸激酶,克氏,结构域,结构示意图

13图 2-1 嗜根考克氏菌的组氨酸激酶和应答调控蛋白结构示意图Figure 2-1 Structural schematic overview on the histidine kinases and the response regulators ofTCS in Kocuria rhizophila注：跨膜螺旋由 TMHMM Server 2.0 预测；保守结构域及其位置由 BLASTp 预测。Note: The putative transmembrane helices were predicted by TMHMM Server 2.0; the conserveddomains and their location are indicated as predicted by BLASTp.一个典型的 HK 包含一个可变传感结构域和一个保守的发射结构域，传感结构域在 PFAM 中称为 HisKA 结构域，通常是化学配体，一般用于检测特定的刺激；发射结构域在 PFAM 数据库中称为 HATPase_c 结构域，包含一个保守的组氨酸残基，通过磷酸化将信号传递到其同源 RR[93, 94]。HATPase_c 结构域结合ATP 并催化 γ-磷酰基从 ATP 转移至位于 HisKA 结构域内的组氨酸残基。此外，HATPase_c 结构域中参与 ATP 结合（G1, F, G2）的几个基序都是高度保守的。在多数情况下，诸如 sCache_3_2 等其他结构域位于 N-末端 HisKA 结构域和 C-末端 HATPase_c 结构域之间。

【相似文献】