海洋琼胶降解菌的分离、琼胶酶研究及三株新菌的鉴定

发布时间：2020-07-17 09:11

【摘要】：海洋是生命的起源地,其中蕴含着丰富的资源,积极开发海洋资源,大力发展蓝色经济,是推动强国战略的重要方面。海洋生物中含有大量可利用的海洋多糖,琼胶是其中重要的组成成分之一,具有广阔的开发应用前景。琼胶降解菌可产生琼胶酶,为实现琼胶多糖的绿色、高效的生物降解提供了有力的工具,受到了广泛关注。本文以琼胶降解菌为主要研究对象,进行一系列研究工作。首先,以分离琼胶降解细菌为出发点,采集威海及日照沿海样品进行海洋微生物的筛选分离,共得到14株潜在新物种和7株琼胶降解菌。对其中的2株海洋新物种O448T和F02T及1株新型琼胶降解菌RQJ05T进行多相分类。经鉴定,菌株0448T呈革兰氏染色阴性、好氧性、无运动性,氧化酶和过氧化氢酶呈阳性,主要的呼吸醌是Q-10,主要的脂肪酸成为是C18:1ω7c,极性脂组成主要有磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱和磷脂酰甘油,结合生理生化特征及遗传学特征分析,菌株0448T确定为红杆菌科中的新属新种,命名为沉积物大洋杆菌(Oceanibium sediminis gen.nov.,sp.nov.);菌株F02T细胞呈革兰氏阴性、严格需氧菌,具有运动性和氧化酶与过氧化氢酶活性,主要的呼吸醌是Q-8,主要的脂肪酸成分是C18:11ω7c、C16:1ω7c、C15:o和C18:1ω9c,主要的极性脂组成有磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺和一种未被鉴定的磷脂,结合生理生化特征及遗传学特征分析,确定为－-变形菌纲中的新属新种,命名为沉积物海栖杆菌(Maribactrumsediminisgen.nov.,sp.nov.);菌株RQJ05T革兰氏染色阴性、好氧型细菌,有运动性,氧化酶呈阳性但过氧化氢酶呈阴性,主要的呼吸醌是Q-8,主要的脂肪酸成分是Summed Feature 3(C16:1ω71 and/or C16:1ω6c)、C16:0 和 Summed Feature 8(C18:1 ω7c and/or C18:1ω6c),极性脂种类主要有磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油和磷脂,结合生理生化特征及遗传学特征分析,确定为交替单胞菌科中的新属新种,命名为嗜琼胶藻生菌(Algilactibacter agarilytica gen.nov.sp.nov.)。对琼胶降解菌QM202T和RQJ05.T进行基因组测序,对琼胶酶基因进行预测分析,共预测出28条潜在琼胶酶基因,其中菌株QM202T中有4条,RQJ05T中有24条。对预测得到的所有琼胶酶基因进行外源表达,对表达产物进行酶活检测,结果显示共有11个琼胶酶具有琼胶降解活性,其中菌株QM202T中有4个,RQJ05T中有7个。然后用亲和层析的方式成功纯化出重组琼胶酶QM202-1与RQJ05-21。最后对纯化后的重组琼胶酶的结构与酶学性质进行探究,结果显示,琼胶酶QM202-1属于GH50家族,最适反应温度为30-40℃,最适反应pH为7.0,DTT能大幅度增加酶活,降解产物为新琼四糖,比酶活为34.7U/mg。琼胶酶RQJ05-21属于GH16家族,最适反应温度为50℃,最适反应pH为8.0,Co2+、Fe2+、DTT能大幅度增加酶活,具有琼胶降解能力的同时也有一定程度降解淀粉、卡拉胶、海藻酸钠的能力,降解琼胶时比酶活为66.5 U/mg且产物为新琼四糖与新琼六糖。本研究分离并得到多株琼胶降解菌与多条琼胶酶蛋白,为实现琼胶多糖的绿色、高效的生物降解提供了有力的工具。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q93
【图文】：

模式和产物的不同，将琼胶酶分类为ａ－琼胶酶（Ｅ．Ｃ．３．２．１．１５８）和（３－琼胶酶逡逑（Ｅ．Ｃ．３．２N８１），ａ－琼胶酶可以将琼胶中的ａ－１，３糖苷键断裂，而ｐ－琼胶酶可逡逑以识别琼胶中的Ｐ－１，４糖苷键并使其断裂，如图１－２所示叩】。其中Ｐ－琼胶酶及逡逑其作用形成的低聚糖吸引了相当多的行业。在藻类、海水和海洋沉积物等海洋环逡逑境中有着丰富的琼胶酶基因资源，将这些基因转入合适的表达宿主所产生的重组逡逑琼胶酶在恶劣环境中的催化效率和稳定性得到了提高，因此适用于大规模的工业逡逑生产。逡逑Ｃｈｅｍｉｃａｌ邋ｌｉｑｕｅｆａｃｔｉｏｎ邋ｏｒ逦，逡逑Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ邋ｌｉｑｕｅｆａｃｔｉｏｎ邋ｂｙａ－ａｇａｒａｓｅ逦Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ邋ｌｉｑｕｅｆａｃｔｉｏｎ邋ｂｙ邋ｐ－ａｇａｒａｓｅ逡逑Ａｇａｒｏｓｅ逦Ａｇａｒｏｓｅ逡逑ｉ逦ｉ逡逑Ｏ＾Ｋ＞＃邋ＣＭＫＭＸ＞＃逦（ＳＫＭＸＸＤ＾逡逑Ａｇａｒｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ逦Ｎｅｏａｇａｒｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ逡逑Ｃｌｅａｖａｇｅ邋ｓｉｔｅ邋Ｔｅｒｍｉｎａｌ邋ｅｎｄ逦Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ邋ｓｕｇａｒ逡逑｜邋ａ－１，３－ｌｉｎｋａｇｅ邋0邋Ｎｏｎ－ｒｅｄｕｃｉｎｇ邋ｅｎｄ邋Ｇａｌａｃｔｏｓｅ逡逑｜逦卩－１．４－ｌｉｎｋａｇｅ逦？邋Ｒｅｄｕｃｉｎｇ邋ｅｎｄ邋（＾）逦ＡＨＧ逡逑图１－２琼胶酶的降解模式图Ｍ逡逑Ｆｉｇ邋１－２邋Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ邋ｍｏｄｅｌ邋ｏｆ邋ａｇａｒａｓｅ逡逑１．２．２琼胶酶的分类逡逑目前

子多糖直接降解为低聚糖聚合物，然后逐渐降解；外切型琼胶酶的底物结合裂缝逡逑相对较小，或者是是以桶状结构呈现，只能作用于琼胶多糖的尾端使其断裂，逐逡逑步降解，产物较为单一［５３］。基于作用模式和琼脂酶催化机制的分类描述如图１－３逡逑所示。逡逑■苷水解酵逡逑作用方式逦o<化机制逡逑Ｉ逦邋ｆ逦？逡逑一邋Ｔ？逦Ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｃ逡逑（＾ＧＨ５０＾）逦Ｉ逦Ｕ逡逑Ｔ逦｜内切酶逡逑ｊ￣￣ｒ逦Ｔ邋；ｒ逡逑（＾７＾）逡逑图１－３琼胶酶所在家族的分类逡逑Ｆｉｇ邋１－３邋Ｃｌａｓｓｉｆｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＧＨ邋ｆａｍｉｌｉｅｓ邋ｏｆ邋ａｇａｒａｓｅｓ逡逑４逡逑

面没有观察到鞭毛，符合没有运动性这一特性。菌株０４４８１＇在ＭＡ培养基上在逡逑３３邋°Ｃ培养２天后，平板上形成微凸、表面光滑、米黄色、直径大约０．８邋ｍｍ左逡逑右的圆形菌落。菌落形态与菌体形态如图３－１所示。该菌株除在本实验室保藏之逡逑夕卜，新鲜菌体送至ＭＣＣＣ与ＫＣＴＣ成功保藏，保藏编号分别为ＭＣＣＣ邋１Ｈ００２３３逡逑与邋ＫＣＴＣ邋６２０７６。逡逑ｉ逡逑ｉ邋ｍｄ哪逡逑１１逦ＮＩＨＨＮ）邋？逦．ＩＮＩ逡逑图３－１菌株０４４８Ｔ的菌落和菌体形态逡逑Ｆｉｇ．邋３－１邋Ｔｈｅ邋ｃｌｏｎｙ邋ａｎｄ邋ｃｅｌｌ邋ｍｏｒｐｈｙｏｌｏｇｙ邋ｏｆ邋ｓｔｒａｉｎ邋０４４８１逡逑２３逡逑

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