巴氏醋杆菌表达载体的构建与应用

发布时间：2020-07-17 13:33

【摘要】：醋酸发酵生产用醋酸菌菌种及其耐酸特性是制约高酸度醋生产的重要因素。而有效的分子克隆工具则是研究醋酸菌耐酸的关键。本文以巴氏醋杆菌Ab3为研究对象,主要从启动子的选择、预测、及荧光蛋白报告基因的成功运用等方面着重介绍了适合巴氏醋杆菌的表达载体的构建过程。本文选择巴氏醋杆菌5个重要耐酸蛋白分别为乙醇脱氢酶(AdhA)、分子伴侣蛋白(DnaK,DnaJ,GrpE)、PqqA 以及 16srDNA为出发点,借助BPROM软件预测其基因上游启动子区。最后根据预测分值,选择PadhA,PgrpE以及PdnaK为对象进行后续研究。三种启动子大小皆为200 bp左右,以pBBR1MCS5抗性替换后得到的pBBRA为基础,成功构建了连有三种不同启动子的表达质粒pBBRAP1,pBBRAP2 以及 pBBRAP3。本文在巴氏醋杆菌中首次并成功运用荧光蛋白报告基因验证了所选启动子的活性。结果表明分别含有重组质粒pBBRAPIGFP,pBBRAP2GFP以及pBBRAP3GFP的重组菌荧光强度远高于对照菌株,证实所选启动子有效且可用于外源蛋白的表达。另外研究还表明启动子的活性与生长周期以及环境压力密切相关,如启动子PadhA的活性在整个生长周期均较高,而分子伴侣蛋白编码基因启动子在生长中后期活性较高。这与巴氏醋杆菌在生长时面对醋酸压力的情况下,蛋白表达情况变化类似,因此本文所开发的基于GFP报告基因的表达体系,可用于目标基因的特定阶段表达研究。在该表达体系的应用方面,本文成功构建了环丙烷脂肪酸合成酶编码基因cfa回补表达质粒 pBBRAPlcfa、pBBRAP2cfa 以及 pBBRAP3cfa,为进一步研究环丙烷脂肪酸在醋酸菌耐酸过程中的作用奠定基础。巴氏醋杆菌表达体系的构建与优化为后续研究特定功能基因提供了坚实的基础,为醋酸菌耐酸机制的进一步揭示,特别是为耐酸蛋白表达时间图谱的探索提供了有力保障。另外本研究的开展有助于进一步揭示菌株Ab3高耐酸调控机制,同时也为其它醋酸菌的类似研究工作的开展提供了思路,继而对于高耐酸醋酸菌种的选育及醋酸发酵工艺的优化具有一定指导意义。
【学位授予单位】：浙江工商大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS201.3
【图文】：

醋酸菌,高酸度

逦－？ＣＨ３ＣＨＯ逦ＣＨｊＣＯＯＨ逡逑图１－１醋酸菌的代谢途径逡逑Ｆｉｇ邋ｌ－ｌ邋Ｔｈｅ邋ｍｅｔａｂｏｌｉｃ邋ｐａｔｈｗａｙ邋ｏｆ邋ａｃｅｔｉｃ邋ａｃｉｄ邋ｂａｃｔｅｒｉａｔｈｅ逡逑醋酸中，有两个属里的大部分菌株能对乙酸进行过氧化，分别是醋酸醋杆菌逡逑属和葡糖醋杆菌属，辅酶Ｑ为反应的催化物。逡逑１．１．３醋酸菌的研究状况逡逑醋酸菌的工业应用价值主要体现在发酵产酸，所以，随着发酵产物的累积，逡逑发酵液也逐渐呈现为酸性。适当的酸浓度有利于醋酸菌的生长与发酵，但当酸积逡逑累到一定程度的时候，又会抑制醋酸菌的生长与发酵。因此，醋酸菌的研究重点＇逡逑在于高耐酸和高产酸两大特性上Ｃ后前／针对高产截和氋耐酸的研宄生要在从三逡逑个方面：一、从工艺学层面出发，改进醋酸菌发酵的工艺，优化接种量、初始逡逑ｐＨ值、发酵温度、发酵时间、碳源、培养基成分比例等，通过各种单因素影响、逡逑正交影响寻找最适合的条件

流程图,质粒提取,流程图,凝胶电泳法

图２－１质粒提取流程图逡逑Ｆｉｇ邋２－１邋Ｐｌａｓｍｉｄ邋ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ邋ｆｌｏｗ邋ｃｈａｒｔ逡逑２．３．２．２琼脂糖凝胶电泳法逡逑脂糖凝胶电泳法流程图见图２－２。逡逑１９逡逑

流程图,抗性基因,氨苄青霉素,高保真

图２－２琼脂糖凝胶电泳法流程图逡逑Ｆｉｇ邋２－２邋Ａｇａｒｏｓｅ邋ｇｅｌ邋ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｆｌｏｗ邋ｃｈａｒｔ逡逑２．３．２．３氨苄青霉素抗性基因的高保真ＰＣＲ克隆逡逑氨苄青霉素抗性基因的克隆以质粒ｐＵＧ６为模板，引物见２．２．４章节，逡逑根据实际电泳显示的ＰＣＲ条带调整退火温度，得到目的基因的克隆片段后，通逡逑过基因测序来检测目的基因的完整性和准确性。ＪＡ／Ｐ的ＰＣＲ体系（５０邋ｐＬ）及程逡逑序如下：逡逑

【参考文献】