杆状病毒AcMNPV口服感染因子P74的剪切位点鉴定

发布时间：2020-07-29 10:09

【摘要】：杆状病毒是一类具有囊膜的双链环状DNA病毒,在其生活史中,产生两种不同类型的病毒粒子:出芽型病毒粒子(budded virus,BV)和包埋型病毒粒子(occlusion-derived virus,ODV)。ODV负责病毒对中肠初始的口服感染,而BV则介导虫体其他组织之间的系统感染。在ODV囊膜表面分布着至少10个与口服感染相关的蛋白,被称为口服感染因子(per os infectivity factors,PIFs)。P74作为首个被报导的口服感染因子,也被称为PIF0,它在ODV感染中肠的过程中经历两次顺序剪切:第一次剪切发生于ODV从多角体(occlusion body,OB)碱解释放的过程中;第二次剪切发生于ODV感染中肠上皮细胞的过程中。目前,对于P74第一次剪切的具体位点及其对口服感染的影响尚不明确。本论文对ODV囊膜蛋白P74的剪切现象进行了深入分析研究,同时还探究了ODV囊膜表面口服感染因子间的相互作用,为深入揭示杆状病毒口服感染的机制奠定了基础。第一章介绍了研究背景,包括杆状病毒的生活史及口服感染的详细过程。同时对口服感染因子,特别是P74的研究现状进行总结分析。第二章对苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)P74蛋白的剪切进行了研究。使用感染细胞样品和虫体来源的ODV样品进行Western blot检测,发现P74在细胞中不发生剪切,而在ODV样品中发生剪切。随后使用特异性抑制胰酶活性的大豆胰蛋白酶抑制剂(soybean trypsin inhibitor,SBTI)进行OB碱解的时相实验,发现SBTI加入时间越晚,P74剪切后的蛋白量越多,由此我们认为P74第一次剪切的可能是由胰蛋白酶或是类胰蛋白酶介导的。随后,根据剪切条带的大小及生物信息学分析,推测了四个保守的精氨酸位点可能为剪切位点,并通过Bac-to-Bac系统构建了缺失p74,回复p74及七种预测剪切位点单、多点组合突变的重组病毒。我们对重组病毒进行扫描电镜及透射电镜观察,发现p74缺失及点突变不影响OB的外部形态及内部ODV的包埋。我们将重组病毒的ODV纯化后进行Western blot检测,发现点突变R325Q/R334Q能够部分抑制P74剪切,四点突变R319Q/R323Q/R325Q/R334Q能够完全抑制P74的剪切,而其他的突变体不能,表明P74发生第一次剪切的位点是第319、323、325和334位的精氨酸。第三章对AcMNPV ODV囊膜表面10个口服感染因子之间的相互作用进行了探究。该实验通过酵母双杂交的方法双向验证各个PIF之间的相互作用,除去PIF5和VP91存在自激活现象无法研究外,共发现了8对双向互作的蛋白,分别是:P74-PIF4、PIF1-PIF2、PIF1-PIF3、PIF1-PIF4、PIF2-PIF3、PIF2-PIF4、PIF3-PIF4、PIF4-Ac110。该实验提示PIFs之间存在着广泛的相互作用,支持了PIF以复合物形式发挥功能这一发现,并为探究各个PIF蛋白在PIF复合物中可能的排布方式提供了重要数据。第四章为总结和展望,对本文的研究进行了总结归纳。
【学位授予单位】：中国科学院大学(中国科学院武汉病毒研究所)
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q939.4
【图文】：

图 1.1 杆状病毒的生活史 (Rohrmann, 2013)e 1.1Baculovirus lifecycle.Baculovirus canbeabsorbed bylarvae taking virus moved to the midgut, ODVs were released from OBs to infect mido start oral infection (A). BVs were produced in infected cells and then rely cells, which was called systemic infection (B). Apart from BVs, oted cells nucleus can be wrapped into ODVs and then assembled with otheIn the end, host cells lysed and OBs were released to start next romann, 2013).病毒结构 ODV 在结构上具有相似的核衣壳组分 (Slack andArif, 200囊膜上 (Hou et al., 2013)。首先在来源上，BV 的囊膜来源 ODV 的囊膜来源于感染细胞的核内膜 (BraunagelandSum膜组分上二者也有很大差异，其中膜融合蛋白尤为明显 (毒入侵和膜融合为单个蛋白——GP64 或 F 蛋白，GP64 属于

图 1.2 HearNPV BV 与 ODV 的蛋白组成和定位模式图 (Hou et al., 2013)igure1.2ProteinscompositionsandlocalizationsofHearNPVBVandODV(Houetal.,20.1.3 杆状病毒的应用因为杆状病毒ODV与BV的组织嗜性不同，因此在应用上也有一定的差异DV 介导口服感染，因此可作为生物杀虫剂，同时杆状病毒特异性地感染节物 (Thiem,2009)，其安全性得到极大的保障，目前以 ODV 为基础研发的生虫剂得到国内外的认可 (Yang et al., 2017 , Sun, 2015 , Inceoglu et al., 2001)。杆状病毒的 BV 可作为基因表达载体，在感染的细胞内大量表达外源蛋Keiletal.,2009,Miller,1989)。1993 年自“bacmid”系统开发以来 (Luckowet993)，BV 作为外源蛋白表达的系统一直在不断的完善与发展，目前已被广泛，同时像病毒样颗粒 (virus-like particles, VLP) 及其他很多类疫苗也是由杆毒表达系统生产 (Contreras-Gomez et al., 2014 , Lin et al., 2014)。此外，杆状病毒可通过转导的方法高效进入到包括人在内多种动物细胞

图 1.3 PIF 复合物模式图 (Wang et al., 2019)re 1.3 Model of PIF complex formation (Wang et al.,主细胞可能是通过 ODV 囊膜和中肠细胞质每个 PIF 在口服感染过程行使的功能尚不明05)，P74、PIF1、PIF2 在 ODV 吸附宿主细胞et al., 2014) 借用 EGFP 标记的 ODVs 发现缺。迄今为止，ODV 膜融合蛋白及受体结合蛋间相互作用白互作的手段通过形成复合物的形式来介导口服感染，因

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本文编号：2773815