基于foldon介导阿魏酸酯酶的寡聚化对催化性能的影响

发布时间：2020-07-30 04:05

【摘要】：阿魏酸酯酶(feruloyl esterase,FAE,EC 3.1.1.73)是羧酸酯酶的一个亚类,它能水解植物细胞壁中阿魏酸与多糖之间连接的酯键,使得木质纤维素原料变得疏松,从而将阿魏酸释放出来。FAE在食品、饲料、医药、造纸、化妆品、生物合成等领域有广泛的应用前景。目前,FAE的催化性能仍有较大提升空间,因此FAE的改造意义深远。本文基于foldon可自发形成寡聚化结构的特性,通过末端融合短肽foldon对FAE进行改造,并对重组FAE活性、酶学性质、寡聚化结构进行探究。主要研究结果如下:(1)从Uniprot数据库中筛选出FAE O42807,根据毕赤酵母密码子偏好性表达将其氨基酸序列转换成fae基因序列,化学合成fae、fae-foldon基因序列,并连接至质粒pPIC9K,构建表达载体pPIC9K-fae、pPIC9K-fae-foldon。将表达质粒电转化至毕赤酵母GS115中,经PCR验证表明,成功获得基因工程菌GS1115/pPIC9K-fae、GS1115/pPIC9K-fae-foldon。(2)设计含有His标签的引物,将其克隆至表达载体pPIC9K-fae及pPIC9K-fae-foldon,成功构建表达载体pPIC9K-His-fae、pPIC9K-His-fae-foldon,电转化至毕赤酵母GS115中,诱导培养后,发酵液经Ni层析柱收集洗脱液,GS115/pPIC9K-His-fae洗脱液经SDS-PEGE分析显示在40 kD处有单一蛋白条带(命名为mon-FAE_2),GS115/pPIC9K-His-fae-foldon洗脱液经SDS-PEGE分析显示有3条蛋白条带,分别为45 kD处的蛋白条带(命名为pro-olig-FAE_2)、110kD处的蛋白条带(命名为tri-FAE_2)及240 kD处的蛋白条带(命名为six-FAE_2),经测定mon-FAE_2的FAE发酵液的酶活力为251.09±7.61 U/L,比活力为0.36±0.011 U/mg;multi-FAE_2(mon-FAE_2、tri-FAE_2及six-FAE_2的混合物)的FAE酶活力为440.78±12.7 U/L,比活力为1.63±0.045 U/mg。(3)为了减少FAE寡聚化时的空间位阻作用,在fae和foldon基因之间插入一段大小为1.63 kD的linker序列,成功构建表达载体pPIC9K-His-fae-linker-foldon,电转化至毕赤酵母GS115中,诱导表达后发酵液经Ni层析柱收集洗脱液,洗脱液经SDS-PAGE分析显示也有3条蛋白条带,分别为45 kD处蛋白条带(命名为pro-olig-FAE_3)、110 kD处的蛋白条带(命名为tri-FAE_3)及240 kD处蛋白条带(命名为six-FAE_3),经测定six-FAE_3的FAE发酵液的酶活力为334.14±11.24 U/L,比活力为1.74±0.063 U/mg。(4)重组FAE理化性质为:三种结构的FAE最适反应温度均为50℃,mon-FAE_2、multi-FAE_2及six-FAE_3在50℃的半衰期分别为99.6 min、129 min及222min。mon-FAE_2的最适反应pH为6.0,且在pH为6.0时稳定性较好,multi-FAE_2及six-FAE_3的最适pH为5.0,且在pH为5.0时稳定性较好。对于mon-FAE_2,Mn~(2+)、Mg~(2+)对其有促进作用,K~+、Ca~(2+)、Fe~(3+)及Cu~(2+)对其有一定的抑制作用,而Zn~(2+)对其有显著的抑制作用,对于multi-FAE_2及six-FAE_3,Mn~(2+)、Zn~(2+)、Ca~(2+)、Mg~(2+)、Fe~(3+)及Cu~(2+)对其有促进作用,K~+对其有一定的抑制作用。multi-FAE_2较mon-FAE_2的比活力提高3.53倍,K_m值减小77.36%,k_(cat)/K_m值提高7.57倍。six-FAE_3较mon-FAE_2的比活力提高3.83倍,K_m常数减小75.16%,k_(cat)/K_m提高8.67倍。(5)25℃时在透射电子显微镜下可观察到multi-FAE_2及six-FAE_3形成了寡聚化结构的蛋白聚集体。动态光散射结果表明随着温度的升高mon-FAE_2的平均粒径保持不变,tri-FAE_2及tri-FAE_3的随着温度的升高逐渐解聚,直至65℃,tri-FAE_2及tri-FAE_3平均粒径大小与mon-FAE_2平均粒径大小几乎一致,说明其已解聚为单体。本论文的实验结果为FAE分子水平的改造提供基础理论研究,该改造酶的方法简单高效,无需事先详细了解酶的3D结构,有很好的应用前景。
【学位授予单位】：华侨大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q816
【图文】：

基于所有已发表的真菌基因组的FAE新系统发育树

FAE的催化机理[2]

（a）foldon结构的侧视图（b）天然foldon结构域中三个β-发夹的相[82]

【参考文献】

相关期刊论文 前5条

1 周燕燕;刘新利;陈静;胡泓宇;侯运华;;黑曲霉h408阿魏酸酯酶基因的克隆及在毕赤酵母中的高效表达[J];微生物学报;2014年08期

2 方园;欧仕益;张宁;;阿魏酸酯酶的制备及其酶学性质[J];暨南大学学报(自然科学与医学版);2012年05期

3 钟丹丹;高美华;李伟伟;张蓓;;CD59-linker-CD2融合基因真核表达系统的构建[J];医学研究生学报;2011年01期

4 李夏兰;范韵敏;方柏山;;来自桔青霉的阿魏酸酯酶的分离纯化、理化性质[J];微生物学报;2010年08期

5 李娟,张耀庭,曾伟,罗璇,廖长春;应用考马斯亮蓝法测定总蛋白含量[J];中国生物制品学杂志;2000年02期

本文编号：2774988