线粒体靶向的苯硫酚荧光探针、衰老相关β—半乳糖苷酶荧光探针的构建以及生物成像研究
发布时间：2020-07-31 14:38
【摘要】：作为细胞的“能量工厂”,线粒体是高毒性环境污染物苯硫酚优先进攻的靶标,同时与痕量苯硫酚残留引起的致病活性氧(ROS)的产生有关。为了实时、准确的监测这些过程,本文开发一种能高灵敏检测线粒体内苯硫酚的荧光探针。检测衰老细胞有助于阐明衰老相关过程以及诊断衰老相关疾病等。衰老相关的β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)作为一种溶酶体水解酶,是目前应用最广泛的细胞衰老生物标志物。但是,在生物体中检测SA-β-gal时,非衰老相关β-gal通常会产生一定的干扰。考虑到SA-β-gal与其它非衰老相关β-gal所处的溶酶体pH有可能不同,本文开发一种能识别溶酶体pH的β-gal荧光探针。具体内容如下:(1)本文开发了一种新型半罗丹明半荧光素(rhodol)染料ROAP,并以此为荧光团、2,4-二硝基苯基为识别基团、吡啶盐为线粒体定位基团,构建了线粒体靶向的苯硫酚荧光探针ROAL。该探针对苯硫酚有高的选择性和灵敏度,且检出限低至8.1 nM。共定位实验表明探针ROAL具有良好的定位线粒体的能力,其皮尔森相关系数高达0.95,从而实现了特异性检测线粒体内苯硫酚。此外,本文还将探针ROAL应用于苯硫酚刺激的固定细胞和活细胞中进行成像研究,结果发现固定细胞显示出强荧光,而活细胞显示出弱荧光,说明苯硫酚会诱导活细胞的线粒体产生活性氧,并且产生的活性氧又能消除苯硫酚。(2)本文以pH敏感的半花菁染料CPH为骨架,β-半乳糖苷键为识别位点,构建了一种可识别溶酶体pH的β-gal荧光探针CA。由于溶酶体的pH范围为4.0-6.0,米曲霉β-半乳糖苷酶(A.oryzaeβ-gal)的活性最适pH为4.0-5.0,大肠杆菌β-半乳糖苷酶(E.coilβ-gal)的活性最适pH为7.4,所以在体外实验中,本文选择A.oryzaeβ-gal和E.coilβ-gal共同验证探针CA的pH敏感性。探针CA与A.oryzaeβ-gal反应显示出绿色荧光,与E.coilβ-gal反应显示出红色荧光,结果表明CA在不同pH下均能检测β-gal,并且呈现出不同的荧光信号,证明探针CA的确可同时检测溶酶体pH和β-gal。本文还将探针CA应用在卵巢癌细胞SKOV-3和不同衰老程度的人胚肺成纤维细胞MRC-5中成像β-gal,实验结果表明探针CA不仅能区分成像SA-β-gal和SKOV-3β-gal,而且也成功监测了细胞的衰老过程。
【学位授予单位】：西北大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：O657.3;Q-334
【图文】：
西北大学硕士学位论文照射，荧光团最高占据轨道 (HOMO) 上的电子被激发到最低空轨道 (LUMO) 上，识别基团的 LUMO 轨道处在荧光团 HOMO 和 LUMO 轨道之间，导致荧光团 LUMO轨道上的电子直接跃迁到识别基团的 LUMO 轨道上而没有办法返回到荧光团的HOMO 轨道上，进而发生荧光猝灭现象。当识别基团与待测物结合或反应后，识别基团的 LUMO 轨道升高，使荧光团 LUMO 轨道上的电子能顺利返回到基态，探针分子的荧光恢复。a-PET 机理则是把荧光团看作电子受体，识别基团看作电子给体。识别基团的HOMO 轨道位于荧光团 HOMO 轨道和 LUMO 轨道之间，识别基团 HOMO 轨道上电子会填充到荧光团的基态，使荧光团 HOMO 轨道上受光激发到 LUMO 轨道上的电子无法再回到基态，从而没有荧光出现。同样地，识别基团与分析物作用后，识别基团的 HOMO 轨道降低，促使荧光团 LUMO 轨道上的电子能正常回到基态，发射出荧光。
图 1.4 ICT 机理的示意图Fig. 1.4 Schematic diagram of ICT mechanism..5.3 荧光共振能量转移基于荧光共振能量转移 (FRET) 机理[20, 24-27]设计的探针通常是由两个不一样光团构成，其中一个是能量给体 (Donor)，另一个是能量受体 (Acceptor)。当受激发时，能量供体由基态跃迁到激发态，发射出荧光，紧接着处于基态的能量受过偶极 偶极相互作用接受到能量给体产生的荧光，提供了能量受体从基态跃迁发态的能量，从而产生荧光发射 (图 1.5)。具有 FRET 效应的荧光探针需要符合条件[26,27]：一、能量受体的吸收光谱和能量给体的发射光谱有一定的重叠；二、给体和受体间的距离必须小于 100 。
图 1.4 ICT 机理的示意图Fig. 1.4 Schematic diagram of ICT mechanism.量转移振能量转移 (FRET) 机理[20, 24-27]设计的探针通常是中一个是能量给体 (Donor)，另一个是能量受体 (A供体由基态跃迁到激发态，发射出荧光，紧接着处于互作用接受到能量给体产生的荧光，提供了能量受从而产生荧光发射 (图 1.5)。具有 FRET 效应的荧光、能量受体的吸收光谱和能量给体的发射光谱有一的距离必须小于 100 。
本文编号：2776605
【学位授予单位】：西北大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：O657.3;Q-334
【图文】：
西北大学硕士学位论文照射，荧光团最高占据轨道 (HOMO) 上的电子被激发到最低空轨道 (LUMO) 上，识别基团的 LUMO 轨道处在荧光团 HOMO 和 LUMO 轨道之间，导致荧光团 LUMO轨道上的电子直接跃迁到识别基团的 LUMO 轨道上而没有办法返回到荧光团的HOMO 轨道上，进而发生荧光猝灭现象。当识别基团与待测物结合或反应后，识别基团的 LUMO 轨道升高，使荧光团 LUMO 轨道上的电子能顺利返回到基态，探针分子的荧光恢复。a-PET 机理则是把荧光团看作电子受体，识别基团看作电子给体。识别基团的HOMO 轨道位于荧光团 HOMO 轨道和 LUMO 轨道之间，识别基团 HOMO 轨道上电子会填充到荧光团的基态，使荧光团 HOMO 轨道上受光激发到 LUMO 轨道上的电子无法再回到基态，从而没有荧光出现。同样地，识别基团与分析物作用后，识别基团的 HOMO 轨道降低，促使荧光团 LUMO 轨道上的电子能正常回到基态，发射出荧光。
图 1.4 ICT 机理的示意图Fig. 1.4 Schematic diagram of ICT mechanism..5.3 荧光共振能量转移基于荧光共振能量转移 (FRET) 机理[20, 24-27]设计的探针通常是由两个不一样光团构成，其中一个是能量给体 (Donor)，另一个是能量受体 (Acceptor)。当受激发时，能量供体由基态跃迁到激发态，发射出荧光，紧接着处于基态的能量受过偶极 偶极相互作用接受到能量给体产生的荧光，提供了能量受体从基态跃迁发态的能量，从而产生荧光发射 (图 1.5)。具有 FRET 效应的荧光探针需要符合条件[26,27]：一、能量受体的吸收光谱和能量给体的发射光谱有一定的重叠；二、给体和受体间的距离必须小于 100 。
图 1.4 ICT 机理的示意图Fig. 1.4 Schematic diagram of ICT mechanism.量转移振能量转移 (FRET) 机理[20, 24-27]设计的探针通常是中一个是能量给体 (Donor)，另一个是能量受体 (A供体由基态跃迁到激发态，发射出荧光，紧接着处于互作用接受到能量给体产生的荧光，提供了能量受从而产生荧光发射 (图 1.5)。具有 FRET 效应的荧光、能量受体的吸收光谱和能量给体的发射光谱有一的距离必须小于 100 。
【参考文献】
相关期刊论文 前1条
1 刘芳宁;梁琪;张炎;张卫兵;;微生物β-半乳糖苷酶的研究进展[J];中国酿造;2012年12期
相关硕士学位论文 前2条
1 潘胜男;Rhodol类生物活性小分子荧光探针的构建以及应用研究[D];西北大学;2017年
2 张亲富;α-Fe_2O_3光催化降解有机物的光谱分析与研究[D];华中科技大学;2012年
本文编号：2776605
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