酵母DNA损伤响应中ATR激酶及其相关复合物的结构研究

发布时间：2020-07-31 18:18

【摘要】：细胞在生长的过程中会遇到各种来自外界或内部的压力,如辐射、化学分子、病毒、氧化自由基等等,这些压力条件很容易造成基因组DNA的损伤。DNA的损伤会造成很多不良后果,如细胞坏死,在高等生物中还有可能造成癌变。为了应对各种不利因素对基因组稳定性带来的影响,真核生物进化出了复杂的DNA损伤响应的机制,修复受损的DNA,调控细胞周期,或者诱导细胞启动凋亡程序。作为一种重要的组蛋白修饰形式,H2B的单泛素化(酵母中K123位点,人源K120位点)广泛地参与DNA复制、基因的转录与表达、DNA损伤修复及异染色质维持等生物过程。组蛋白修饰是染色质调控的重要方式之一。酿酒酵母H2B的泛素化由Rad6/Bre1(泛素结合酶Rad6,泛素连接酶Bre1)复合体进行催化。到目前为止还不清楚Rad6/Bre1如何结合泛素泛素激活酶Uba1和核小体。我们内源性地从酵母细胞中分别纯化得到了 Uba1和Rad6/Bre1复合体,并体外组装了 Uba1-Rad6-Bre1复合物和核小体-Rad6-Bre1复合物。三维重构发现,Rad6/Bre1稳定结合在Uba1上部,首次发现了泛素化修饰的三个酶形成了稳定的复合物,暗示了体内也存在三种酶相互结合的可能性。这完全不同于已知的由泛素结合酶单独结合泛素激活酶并接受泛素后再结合泛素连接酶的结合方式,所以Uba1、Rad6和Bre1之间传递泛素的方式可能是独特的。此外,Rad6/Bre1也能稳定地结合核小体,首次获得了完整的Rad6/Bre1与底物结合的复合物,证明了体外组装完整核小体-Rad6-Bre1复合物的可能性,为后续进一步解析核小体-Rad6-Bre1复合物的冷冻电镜结构奠定了基础。在DNA损伤响应通路中,最关键的两种调控蛋白是ATM(ataxia-telangiectasia mutated)和 ATR(ATM-and Rad3-related)激酶,位于损伤响应信号传导的最上游。ATR在DNA的单链损伤响应以及稳定复制叉结构中起到核心的调控作用,是细胞不可缺少的关键激酶。目前已有人源ATR/ATRIP(ATR interacting protein)复合物以及来源于酿酒酵母的ATR/ATRIP同源蛋白Mec1/Ddc2的高分辨率冷冻电镜结构。但是目前解析的结构是未激活状态的ATR/ATRIP结构。由于ATR下游调控了众多细胞进程,所以其活性受到多种因子的严格调控。但是目前并不知道ATR/ATRIP和其他多种因子之间的相互作用方式,对于ATR的激活机制还并不清楚。我们解析了来源于裂殖酵母的ATR/ATRIP同源蛋白Rad3-Rad26在体内羟基脲(Hydroxyurea,HU)诱导激活状态下的8.8A冷冻电镜结构。HU能够抑制dNTP池从而造成DNA复制的停滞,引起DNA复制胁迫。Rad3-Rad26的整体结构与酿酒酵母Mec1/Ddc2—样呈蝴蝶状,但是其结构稳定性更低,体现在其HEAT区域的结构非常灵活,具有多种构象状态。激酶结构域结构相对较为稳定,在不同物种间保持更高的保守性。通过体外活性检测证实了HU的体内激活效果。结合体外孵育和电镜分析,发现多个DNA损伤检验点复合物蛋白能不同程度地体外激活Rad3-Rad26。并能与Rad3-Rad26在体外稳定相互作用形成复合物。结合检验点复合物蛋白后Rad3-Rad26的构象分布发生一定程度的变化,开放状比例减少,蝴蝶状比例增,尤其是完整的检验点复合物组分能最显著地影响Rad3-Rad26的活性和构象分布。脂肪酸的合成和代谢与细胞的生长状态密切相关。脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FAS)能体内合成软脂酸和硬脂酸。最近的研究表明ATR参与调控细胞代谢和运动,而FAS也与基因组的稳定性密切相关。但是两者之间的关联还不得而知。我们在内源性纯化Rad3-Rad26时,意外发现了有脂肪酸合成酶FAS稳定的共纯化。我们解析了共纯化的FAS和单独纯化的FAS的冷冻电镜结构,分辨率分别为4.7A和5.1A。两种FAS的整体结构与酿酒酵母中FAS的结构高度保守,为D3对称的桶形结构。通过比较共纯化的FAS和单独FAS的结构,我们发现FAS的底物传递核心ACP(acyl carrier protein)结构域具有明显的差异。在共纯化的FAS中,ACP稳定结合在AT(acyltransferase)结构域底物入口处,而单独纯化的FAS中无法清晰指认ACP结构域的位置。通过荧光成像发现FAS在正常条件和多种DNA损伤应激条件下都分布在细胞质中,没有进入细胞核;但是Rad3可以同时分布在细胞核与细胞质当中,并且在DNA损伤应激条件下细胞质分布的细胞比例明显提高。因此Rad3与FAS的相互作用有可能是通过Rad3的出核实现的。本论文中,我们初步探究了酿酒酵母中H2B泛素化过程中修饰酶及其与核小体底物之间的结合方式。首次得到了三种泛素修饰酶的复合物以及修饰酶与核小体的复合物,表明了 Rad6不需要与Bre1解离即可结合Uba1,暗示了可能的新的泛素传递方式,初步实现了核小体与Rad6/Bre1的体外组装,为进一步探究H2B泛素化修饰的机制提供了基础。解析了裂殖酵母中ATR/ATRIP的同源蛋白Rad3-Rad26在HU体内激活状态下的中等分辨率的冷冻电镜结构,发现了Rad3-Rad26独有的高度动态以及二体相互作用界面的变化,加深了对Rad3-Rad26的结构认识。体外研究了检验点复合物相关成员对Rad3-Rad26的调控,指示了进一步体外组装检验点复合物需要RPA、9-1-1、Rad4以及ATPγs。发现了 Rad3-Rad26与FAS的共纯化以及Rad3-Rad26对FAS结构的稳定作用,暗示了 Rad3-Rad26可能直接参与了脂肪酸合成的调控,将DNA损伤响应与脂肪酸合成更直接地联系起来。
【学位授予单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q78
【图文】：

的响应ＤＮＡ损伤的应答机制，针对细胞不同时期和ＤＮＡ受损的程度及类型，逡逑采取不同的修复策略，同时调控细胞代谢和细胞周期的进程，防止损伤效应的进逡逑一步扩大（图１．１）。逡逑Ｉ邋Ｃｅｌｌｕｌａｒ逦ｊ逦｜逦ＵＶ邋Ｌｉｇｈｔ逦｜逦Ｉｏｎｉｚｉｎｇ逦Ｃｈｅｍｉｃａｌ逦｜逦Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ逦｜逡逑Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ逦Ｉ逦Ｉ逦Ｅｘｐｏｓｕｒｅ逦Ｉ逦１邋Ｒａｄｉａｔｉｏｎ逦Ｉ逦Ｅｘｐｏｓｕｒｅ逦Ｉ逦Ｅｒｒｏｒｓ逡逑r2邋暑邋Ａ，邋pc逡逑是邋ｙ＼逦＼丨逦ｉ－邋／／Ｎｙ＞邋｜逡逑Ｄａｍａｇｅ逦、逡逑Ｃｅｌｌ邋Ｃｙｄｅ邋Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ逦Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ逦ＤＮＡ邋ＲｅｐａＪｒ逦Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ逡逑Ａｃｔｕａｔｉｏｎ逦Ｐｒｏｇｒａｍ邋Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ逦＊邋Ｄｉｒｅｃｔ邋ｒｅｖｅｒｓａｌ逡逑？逦Ｂａｓｅ邋ｅｘｃｉｓｉｏｎ邋ｒｅｐａｉｒ逡逑逦邋逦邋＊邋Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ邋ｅｘｃｉｓｉｏｎ邋ｒｅｐａｉｒ逦逦逡逑？逦Ｍｉｓｍａｔｃｈ邋ｒｅｐａｉｒ逡逑？逦Ｄｏｕｂｌｅ邋ｓｔｒａｎｄ邋ｂｒｅａｋ邋ｒｅｐａｉｒ逡逑？逦Ｈｏｍｏｔｏｇｏｕｓ邋ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ逡逑？逦ＮｏｒｖｈｏｍｏｌＯＱＯｕｓ邋ｅｎｄ邋ｊｏｌｎｉｎｆｌ逡逑＃荆rP遥Γ希rP樱鈹螅簦澹恚螅嗑rP桑睿悖]3?图１．１邋ＤＮＡ损伤及其影响［３］逡逑上方展示了各种ＤＮＡ损伤因素，下方展示了细胞发生的ＤＮＡ损伤响应逡逑在ＤＮＡ损伤响应通路中主要包括感受因子、传递因子、中介因子和效应因逡逑１逡逑

造成核小体结构的改变，进而影响其他修饰的发生。Ｈ２Ｂ的泛素化会引起组蛋逡逑白Ｈ３不同位点的甲基化水平发生改变，进而影响下游基因表达、细胞周期调节、逡逑ＤＮＡ损伤修复等众多过程［９－１１］（图１．４）。所以Ｈ２Ｂ的泛素化修饰是维持染色逡逑质和基因组稳定性的上游调控因素之一。酵母中Ｈ２Ｂ泛素化涉及到的三种酶分逡逑别是泛素激活酶Ｕｂａｌ邋（Ｅ１），泛素结合酶Ｒａｄ６邋（Ｅ２），泛素连接酶Ｂｒｅｌ邋（Ｅ３）逡逑［１２－１５］。在果蝇和人体中也存在这几种酶的同源蛋白，并且在不同物种的真核生逡逑物中，组蛋白的差异很小，可见这种修饰是从酵母到人都高度保守的。逡逑泛素化是细胞中一类常见的蛋白质翻译后修饰方式，通常发生在细胞质当中。逡逑目的蛋白被多次泛素化修饰，形成泛素链，介导蛋白质的降解［１６］。但Ｈ２Ｂ只会逡逑被单泛素化，不会形成泛素链。这种泛素化并不会导致蛋白质的降解，而是起到逡逑调控的作用。另外，在组蛋白Ｈ２Ａ上也存在泛素化位点，如Ｈ２ＡＫ１１９［１７］，所逡逑以Ｈ２Ｂ泛素化的位点特异性的机制知之甚少

璐痧逦％逡逑ｎ逡逑图１．３组蛋白不同位点修饰示意图（图片来自网络）逡逑组蛋白用不同颜色的带有尾巴的球表示，蓝色为Ｈ２Ａ，黄色为Ｈ２Ｂ，绿色为Ｈ３，红色逡逑为Ｈ４。不同种类的修饰用不同颜色和形状的斑块标注在其发生的位点。图片来源逡逑ｈｔｔｐｓ：／／ａｉｒｆｒｅｓｈｅｎｅｒ．ｃｌｕｂ／ｑｕｏｔｅｓ／ｄｉａｇｒａｍ－ｈｉｓｔｏｎｅ－ｏｃｔａｍｅｒ．ｈｔｍｌ逡逑在酵母中，Ｈ２ＢＫ１２３邋（人源为Ｈ２ＢＫ１２０）可以被泛素化修饰。这种修饰会逡逑造成核小体结构的改变，进而影响其他修饰的发生。Ｈ２Ｂ的泛素化会引起组蛋逡逑白Ｈ３不同位点的甲基化水平发生改变，进而影响下游基因表达、细胞周期调节、逡逑ＤＮＡ损伤修复等众多过程［９－１１］（图１．４）。所以Ｈ２Ｂ的泛素化修饰是维持染色逡逑质和基因组稳定性的上游调控因素之一。酵母中Ｈ２Ｂ泛素化涉及到的三种酶分逡逑别是泛素激活酶Ｕｂａｌ邋（Ｅ１），泛素结合酶Ｒａｄ６邋（Ｅ２），泛素连接酶Ｂｒｅｌ邋（Ｅ３）逡逑［１２－１５］。在果蝇和人体中也存在这几种酶的同源蛋白，并且在不同物种的真核生逡逑物中，组蛋白的差异很小，可见这种修饰是从酵母到人都高度保守的。逡逑泛素化是细胞中一类常见的蛋白质翻译后修饰方式

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