基于基因组和转录组分析的Bacillus megaterium BM2的形态学研究

发布时间：2020-08-01 12:36

【摘要】：巨大芽孢杆菌(Bacillusmegateium),芽孢杆菌属,为革兰氏阳性菌,形体细长,相比其他微生物比较大,菌落形态规则,呈圆形,表面圆润无褶皱,上有凸起。巨大芽孢杆菌因其具有营养要求低等优点,现已广泛的被应用于工业与学术研究领域,包括微生物肥料、生物的防治、畜牧业、水体的净化和蛋白表达上的研究与应用。在巨大芽孢杆菌的应用领域,发酵生物量低、生产成本高一直是限制其大规模应用的瓶颈。课题组前期在造纸黑液池中分离到的一株菌体形态小、发酵密度明显提高数倍的巨大芽孢杆菌B.megaterium BM2,通过与其它标准巨大菌株进行发酵比较,发现其菌体形态大小与所产芽孢的大小均比标准菌株小,因此猜测其具有较高的发酵密度与菌体的形态有关。该菌株的优势使其在异源表达和微生物菌剂方面具有巨大的应用潜力。本论文针对形态学和芽孢形成相关基因进行研究。首先对其进行全基因组测序,通过基因组和比较基因组分析初步找出了BM2菌株中可能与形态有关的基因,包括特有的壁磷壁酸合成有关基因(1751、1752)和与脂磷壁酸合成相关基因(/tasa、ltasb、ltasB)以及棒状结构蛋白MreB。利用温度敏感型敲除载体pKVM1构建敲除载体,通过对转化方法进行探索,确定了利用E.coli S17-1接合转移,插入失活的原理进行基因敲除的敲除体系。随后对筛选出的形态相关基因1751、1752、ltasa、ltasb、ltasB和mreB进行基因敲除,构建了一系列与形态有关的单个(B.megaterium BM2/Δ1751、B.megaterium BM2/Δ1752、B.megaterium BM2/Δ/ltasa、B.megaterium BM2/Δltasb、B.megaterium BM2/AltasB、B.megaterium BM2/ΔmreB)或多个敲除突变体(B.megaterium BM2/Δ1751Δ1752、B.megaterium BM2/ΔltasBΔltasb),并通过生长验证观察其生理变化,利用电镜技术观察其形态变化,以确定这些基因对菌体生长、细胞壁形成及菌体形态的影响。通过对各个敲除菌株进行生理生化和形态分析,我们发现基因1751、1752、ltasa、ltasd、ltasB的单个或者多个缺失会造成菌体生长变慢,而mreB基因的缺失使得菌株在发酵培养基的生物量提高。在细胞形态上,通过扫描电镜可以看出上述基因的缺失在不同程度上影响了细胞大小和形状,如磷壁酸合成相关基因的缺失会使得对数生长期的细胞变大(ltas)或者变小(17511、1752),mreB基因的缺失使得芽孢的生成受到严重抑制,并且细胞形态出现方形或者球状。另外,TEM和Western Blot实验均表明上述基因的丢失会引起细胞壁成分的改变,这也是引起生长和形态发生变化的可能原因之一。这些发现说明了我们初步筛选出的与形态有关的基因对菌体的生长及细胞大小有一定的影响,并且有的基因与芽孢形成相关。最后通过转录组分析B.megaterium BM2在生长周期中的基因表达水平变化。一方面在基因表达水平上验证了本论文中筛选出的形态相关基因的表达量差异;另一方面为进一步探索与细胞形态和芽孢形成相关的其它基因提供数据支撑。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q93
【图文】：

革兰氏阳性菌,细胞壁,多元醇,磷酸二酯

磷壁酸是指包括含有磷酸二酯连接的多元醇重复单元的多种细胞表面糖聚合物逡逑家族（Ｗａｒｄ，邋１９８１）。磷壁酸包括通过糖脂锚定在细菌膜中的脂磷壁酸（ＬＴＡ）和逡逑与肽聚糖共价连接的ＷＴＡ邋（Ｎｅｕｈａｕｓ邋ｅ／ｆｌ／．，邋２００３；邋Ｗａｒｄ，邋１９８１）（图１－２）。所有相逡逑关的淲壁酸是富含磷酸盐的聚合物的异质类，其与革兰氏阳性细菌的细胞壁肽聚逡逑糖共价连接。它们由磷酸二酯连接的多元醇的主链或通过连接单元与肽聚糖连接逡逑的糖部分组成。甘油和核糖醇是最常见的多元醇，通常被Ｄ－丙氨酸或各种糖残逡逑基取代。逡逑５逡逑

示意图,组装过程,示意图,脂磷壁酸

在革兰氏阳性菌中，脂磷壁酸（ＬＴＡ）被定义为一种通过脂质锚定与细胞膜逡逑外连接的含有高双磷酸盐和复杂的含糖基磷酸盐聚合物。Ｗｅｂｂ邋ＡＪ首先提出了逡逑ＬＴＡ在单核细胞增多性李斯特氏菌中的合成途径（图１－４）邋（Ｗｅｂｂ邋ｅ／以，２００９）。逡逑根据它们的化学结构，脂磷壁酸被分为不同的类型。Ｉ型ＬＴＡ具有简单的不分支逡逑聚甘汕磷酸酯骨架结构，而ＩＩ型到Ｖ型ＬＴＡ具有更为复杂的结构。Ｉ型聚甘油逡逑磷酸酯的产生与膜脂代谢密切相关，其合成勹革兰氏阴性菌中渗透调节的周质葡逡逑聚糖的产生具有惊人的相似性。ＬＴＡ在细菌生长和生理过程中起着重要的作用，逡逑有助于细胞膜的稳态和毒力。另外，ＬＴＡ的本质使其具有成为疫苗和新型抗菌素逡逑的潜力（Ｐｅｒｃｙ邋ｅＺ邋ａ／．，邋２０１４）。逡逑ＬＴＡ逡逑ＤＡＧ邋Ｇａ｜＾｜°ＰＤＡＧ逦ＤＡ0邋Ｚ逡逑ＯＵＴＳＩＤＥ逦（－逦３逡逑逦？￣￣Ｇａｌ＾ｌｃ－ＯＡＧ逦——－ｆ邋￣￣＿严邋ｆ邋ｆ逡逑逦９逦?￣Ｗｍ￣￣ｐＰ＾＾—ｍ逦逡逑？逦Ｌｍｏ２５５３逦Ｌｍｏ０６４４逦Ｌｍｏ０９２７逡逑？牛邋ＵＤＰ邋＾ＡＵＰＰ逦ＬａｆＣ逦ＬｔａＰ逦ＬｔａＳ逡逑Ｌｍｏ２５５５邋＾逦Ｌｍｏ２５５４邋＾逡逑ＬａｆＡｕ0Ｐ＾，ｃ邋＂＂ｕＤＰ＾ａ，逦ＣＹＴＯＰＬＡＳＭ逡逑？邋？逡逑

原理图,基因敲除,双交换,细菌

逡逑图１－４单核细胞增多性李斯特氏菌中ＬＴＡ合成途径逡逑Ｆｉｇ．邋１邋－４邋ＬＴＡ邋ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ邋ｐａｔｈｗａｙ邋ｉｎ邋Ｌｉｓｔｅｒｉａ邋ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ逡逑１．５基因敲除体系逡逑基因敲除技术是一种８０年代新发展起来的分子生物学技术，其通过一定的逡逑途径使特定的基因失活或者缺失，从而研宄特定基因的特性。基因敲除在广义上逡逑是指运用ＤＮＡ同源重组的原理，利用最初设计好的同源片段替代目标基因的片逡逑段，从而实现目的基因的敲除（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，ｅ？ａ／．，１９８９）。逡逑到目前为止，最普遍的是利用同源重组原理进行基因编辑。Ｓｅｒｖａｎｔ等早在逡逑１９９９年利用ｐＲＮ５１０１在球状芽孢杆菌中实现ｃ／ｙ基因的重组（Ｓｅｒｖａｎｔ扣ａ／．，１９９９）；逡逑Ｅｓｐｉｎａｓｓｅ等同样利用ｐＲＮ５１０１质粒构建的载体在苏云金芽孢杆菌中成功对逡逑和邋ｅｃ／Ｔ等基因进行敲除（Ｅｓｐｉｎａｓｓｅｅｆａ／．，２００４，Ｅｓｐｉｎａｓｓｅｅｆａ／．，逡逑２００４）

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