Alteromonas sp. Y-389普鲁兰酶的分子改造及其热稳定性研究
发布时间：2020-08-01 16:09
【摘要】：普鲁兰酶是一种淀粉脱支酶,它能够专一的水解支链淀粉的α-1,6-糖苷键形成直链淀粉。它可以与α-淀粉酶共同作用,完全地水解淀粉,因而在淀粉加工、啤酒酿造以及功能性药物多糖的工业生产中具有重要的作用。菌株的胞外分泌能力是衡量工程菌株性能的重要指标,高效的分泌能力可以有效的降低生产成本;淀粉的糖化一般都是在60℃、pH 4.5-pH 6.0之间的条件下进行,而且一般糖化时间为48-60小时。因此,提高重组菌株的酸碱适应性、胞外分泌能力与热稳定性对于淀粉加工过程中降低生产成本和改进生产工艺具有重要意义。本论文以Alteromonas sp.Y-389普鲁兰酶(PulA)为研究对象,基于多序列比对与结构域分析,构建了5个结构域截断突变体与4个定点突变体。研究了切除普鲁兰酶的不同结构域、构建不同点突变对其催化活性与酶学性质的影响,最终得到了酶学性质比较好的叠加突变体。主要的研究结果如下:(1)在Alteromonas sp.Y-389普鲁兰酶序列比对分析与结构域分析的基础上,以重组天然酶质粒为模板(PulA+pET-28a),成功构建了1个N端、4个C端突变体菌株。除Puld4不具有普鲁兰酶的活性之外,其它4个截断突变体均表现出普鲁兰酶活性,而且4个截断突变体的胞外酶分泌效率随着蛋白质分子量的减小而逐渐增强,胞外酶活性占总酶活性的比例分别为13.5%、18.2%、20.1%和30.8%,与PulA重组菌株没有分泌能力相比有了很大的提高。酶学性质的分析表明,截断突变体与PulA的最适pH都为pH 6.0左右,但是截断突变体的作用pH范围变得更窄。Puld1、Puld2和Puld3与天然普鲁兰酶的最适作用温度为35℃,Puld5的最适作用温度为45℃,比天然普鲁兰酶的提高了10℃,半衰期达到了25 h,为天然酶的2.5倍,但是结构域的切除造成的空间结构的变化导致截断突变体与底物结合的能力降低了,随之催化效率也降低了。(2)基于多序列比对以及氨基酸性质分析,选择了保守区域及保守区域周围几个氨基酸作为突变位点,构建了4个定点突变体以及一个叠加突变体。突变体的酶学性质分析结果显示,突变体G603D和F654Y的比活力比重组天然酶的降低了43.7%和8.9%,突变体H611Q和F751L的比活力比重组天然酶的分别升高了64%和30.2%,叠加突变体与截断突变体Puld5相比,其胞外分泌能力提高了4%。除G603D突变体与PulA的最适作用温度都为35℃之外,其它突变体的最适温度都有所提高。除突变体G603D之外,其它普鲁兰酶突变体的热稳定性都有不同程度的提高,PulA的半衰期仅仅只有10 h左右,普鲁兰酶突变体F654Y、H611Q、F751L和Puld5/H611Q的半衰期分别为20 h、20 h、15 h和50 h,分别是天然普鲁兰酶的2倍、2倍、1.5倍和5倍,截断突变体与点突变体的相互叠加使得热稳定性得到了很大的提高。动力学参数分析结果显示,截断突变体的K_(cat)/K_m为天然酶的1.17倍,弥补了只切除结构域造成的催化效率降低的缺点。本研究通过一系列的分子改造,探究了结构域切除以及定点突变对天然普鲁兰酶酶学性质的影响,得到了催化活性与酶学性质较为优良的叠加突变体Puld5/H611Q,为普鲁兰酶的工业化生产奠定了良好的实验基础。
【学位授予单位】：自然资源部第一海洋研究所
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q936
【图文】：
1图 1-1 支链淀粉(左)和直链淀粉(右)的结构Fig. 1-1 The structure of amylopectin (left) and amylose (right)淀粉在工业领域得到了非常广泛的应用，它能够通过发酵产生氨基酸、酶制剂和乳酸等多种化合物 (DiasFFetal.,1997;ChangLT,1998)，化工、制药、纺织、日化等工业领域不可或缺。无论是淀粉发酵还是淀淀粉大分子的水解步骤都是必不可少的，目前，由于 α-1,4-糖苷键水解比较早，技术比较成熟，因此大量性能优良的产品被开发出来。虽然淀1,6-糖苷键只占所有糖苷键的 6%左右，但是它的存在使得淀粉形成大结构，导致支链淀粉在淀粉原料中的比例达到了 70%-80%。因此，α-1水解酶能够大大提高淀粉的利用率。但是，目前市面上支链淀粉水解酶而且大部分依赖于进口，价格比较昂贵。
图 1-2 普鲁兰酶的作用机制Fig. 1-2 The hydrolysis mechanism of pullulanase.3 普鲁兰酶的产生菌株自从 1961 年普鲁兰酶在产气气杆菌(Aerobacteraerogenes)中被首次发现在许多微生物中发现了它的存在。如下表 1-1，分别为产 Ⅰ 型普鲁nder, et al., 1961)和产 Ⅱ 型普鲁兰酶(Domań-Pytka et al., 2004)的菌株。
图 1-3 来源于 Bacillus acidopullulyticus 的普鲁兰酶Fig. 1-3 Pullulanase from Bacillus acidopullulyticus注：PDB ID：2WAN鲁兰酶的应用兰酶的主要作是水解 α-1,6-糖苷键，在淀粉水解过程中能够将使所有的淀粉结构都变为直链。为了提高淀粉质原料的利用率水解完成 α-1,4-糖苷键之后，再配合普鲁兰酶的作用使之完全工业中，液化和糖化是最关键的两个步骤，液化过程就是淀粉低，主要是淀粉酶的作用；糖化过程中可以加入普鲁兰酶，对于原料的利用率有很大的提高(Hii S L et al., 2012)。
【学位授予单位】：自然资源部第一海洋研究所
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q936
【图文】：
1图 1-1 支链淀粉(左)和直链淀粉(右)的结构Fig. 1-1 The structure of amylopectin (left) and amylose (right)淀粉在工业领域得到了非常广泛的应用，它能够通过发酵产生氨基酸、酶制剂和乳酸等多种化合物 (DiasFFetal.,1997;ChangLT,1998)，化工、制药、纺织、日化等工业领域不可或缺。无论是淀粉发酵还是淀淀粉大分子的水解步骤都是必不可少的，目前，由于 α-1,4-糖苷键水解比较早，技术比较成熟，因此大量性能优良的产品被开发出来。虽然淀1,6-糖苷键只占所有糖苷键的 6%左右，但是它的存在使得淀粉形成大结构，导致支链淀粉在淀粉原料中的比例达到了 70%-80%。因此，α-1水解酶能够大大提高淀粉的利用率。但是，目前市面上支链淀粉水解酶而且大部分依赖于进口，价格比较昂贵。
图 1-2 普鲁兰酶的作用机制Fig. 1-2 The hydrolysis mechanism of pullulanase.3 普鲁兰酶的产生菌株自从 1961 年普鲁兰酶在产气气杆菌(Aerobacteraerogenes)中被首次发现在许多微生物中发现了它的存在。如下表 1-1，分别为产 Ⅰ 型普鲁nder, et al., 1961)和产 Ⅱ 型普鲁兰酶(Domań-Pytka et al., 2004)的菌株。
图 1-3 来源于 Bacillus acidopullulyticus 的普鲁兰酶Fig. 1-3 Pullulanase from Bacillus acidopullulyticus注：PDB ID：2WAN鲁兰酶的应用兰酶的主要作是水解 α-1,6-糖苷键，在淀粉水解过程中能够将使所有的淀粉结构都变为直链。为了提高淀粉质原料的利用率水解完成 α-1,4-糖苷键之后，再配合普鲁兰酶的作用使之完全工业中，液化和糖化是最关键的两个步骤，液化过程就是淀粉低，主要是淀粉酶的作用；糖化过程中可以加入普鲁兰酶，对于原料的利用率有很大的提高(Hii S L et al., 2012)。
【参考文献】
相关期刊论文 前10条
1 孙U
本文编号：2777689
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/2777689.html
