盐胁迫条件下非洲哈茨木霉胞外聚合物的组成及功能研究

发布时间：2020-08-02 16:34

【摘要】：胞外聚合物(Extracellular polymeric substances,EPSs)是由微生物分泌并附着在细胞壁表面的多聚糖和蛋白质等复合物,在保持细胞形态、胞外酶的分泌以及胁迫环境下的积极防御等方面起着重要作用。本文旨在探究不同浓度的NaCl胁迫下耐盐性有差异的两株木霉菌的胞外聚合物组成和功能并初步分析了其耐盐机理。主要研究结果如下:1.依据ITS/TEF/RPB序列ACCC 32524和ACCC 32527菌株鉴定为非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)。不同盐分对ACCC 32524和ACCC 32527生长抑制情况依次为Na_3PO_4NaClNaNO_3Na_2SO_4乳酸钠。以葡萄糖为碳源,二者的EPSs主要成分均为多糖类物质。在高盐(0.6 mol/L NaCl)胁迫5天后,ACCC 32527可分泌大量的EPSs多糖,较对照提高了1.1倍,显著高于ACCC 32524。2.ACCC 32524和ACCC 32527的EPSs中有2种不同分子量的多糖组分(EPSs-1和EPSs-2)。随NaCl浓度增加,多糖分子量增大,EPSs-1相对含量降低,而EPSs-2相对含量提高,且EPSs-1组分中的葡萄糖含量降低,而半乳糖和甘露糖的含量则显著上升。3.通过EPSs与NaCl溶液作用前后的红外光谱图比较发现EPSs对NaCl无吸附作用。NaCl胁迫处理后,ACCC 32524和ACCC 32527 EPSs多糖抗氧化活性呈相反的变化趋势,即随着NaCl胁迫浓度增高,ACCC 32524 EPSs多糖氧自由基和ABTS~+·清除能力下降,而ACCC 32527 EPSs多糖的氧自由基和ABTS~+·清除能力增强。4.分析了有无NaCl胁迫下ACCC 32524和ACCC 32527的差异转录组和代谢组,共获得44,594条单基因和336个代谢产物。在NaCl(0.4和0.6 mol/L)胁迫下,共有31个糖类转运蛋白、多糖合成酶(糖基转移酶、多糖脱乙酰酶等)等相关基因发生上调表达。此外,筛选出ACCC32524中8个渗透调节,7个抗氧化酶和6个细胞壁及胞外物质(疏水蛋白)合成的相关基因;ACCC 32527中7个渗透调节,13个抗氧化和4个细胞壁及胞外物质(疏水蛋白)合成的相关基因,且在NaCl胁迫下多数为上调表达。与ACCC 32524相比,ACCC 32527在NaCl胁迫下,多糖合成的前体物质葡萄糖-1-磷酸以及真菌渗透调节的关键物质(如甘油、氨基酸及其衍生物等)积累量较高。5.以果糖、木糖、丙三醇、甘露醇或蔗糖为碳源时,ACCC 32524和ACCC 32527的EPSs主要成分为蛋白质,其次为多糖类物质。不同碳源培养下,NaCl胁迫均能促进EPSs中多糖物质的合成,其中以木糖最为明显,含量较对照提高41%以上。以蔗糖为底物时,ACCC 32524和ACCC32527的EPSs多糖获得最大自由基清除能力。不同碳源及NaCl胁迫对ACCC 32524 EPSs多糖组分种类无明显影响,但可改变单糖间比例。本论文以非洲哈茨木霉ACCC 32524和ACCC 32527为研究对象,通过分析有无盐胁迫下的EPSs组成、抗氧活性、转录组和代谢组的差异,初步确定了与EPSs合成相关的关键基因和代谢产物,为揭示真菌的抗盐机制提供了重要数据并初步奠定了理论基础。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q935
【图文】：

形态图,形态图,菌丝,生物胁迫

图 1.1 完整菌丝 3-D 形态图D topographical image of an entire hyphal branch (Gazze et al., 2013) EPSs 真菌主要包括大多数的担子菌等大型真菌、丝状真菌在生态环境中主要承担分解者的角色，其 EPSs 与工究都有着密切的关系。本文将近年来文献报道中在实验见表 1.1。根据 EPSs 的研究方向的不同，可将其来源分主要研究生物胁迫或非生物胁迫下 EPSs 的防御机制、是挖掘 EPSs 潜在的体外医药生物活性。

示意图,外界环境条件,示意图,碳源

图 1.2 影响 EPSs 特性的外界环境条件示意图Fig. 1.2 Schematic of external environmental conditions affecting EPSs characteristics (Shi et al., 2017)养基组分室条件下，微生物合成 EPSs 对底物的选择有一定的偏好性。通常，蔗糖是大多数Ss 的最佳碳源(Liang and Wang, 2015)，而真菌一般利用葡萄糖作为碳源(杨同香等, 2人员在对粉质棒束菌（Isaria farinosa）(Wang et al., 2008)、出芽短梗霉（A. pullull., 2014)、里氏木霉（T. reesei）(陈鑫等, 2017)和蝙蝠蛾拟青霉（P. hepiali）(Wu et al., 发酵培养基进行单因素条件优化后发现，蔗糖是利于 EPSs 合成和菌丝生长的最适碳不同菌株碳代谢相关的酶类及转运能力差异相关。丝状真菌发酵碳源种类的差异不Ss 的产量，还可直接导致 EPSs 结构的变化。以蔗糖作为唯一碳源进行葡萄肉座菌EPSs 发酵，多糖的支链结构要少于以果糖为碳源时合成的多糖 10%左右，而其它构、糖苷键类型）基本相同（Silva et al., 2005）。另一方面，发酵液中碳源含量也会合成。如以蔗糖为碳源进行出芽短梗霉（A. Pullulans）EPSs 发酵时，浓度一般控制在蔗糖浓度过低（小于 2.5%），因碳源的缺乏而无多糖合成；若浓度高于 12.5%时，抑制作用也不利于多糖的合成(王长海等, 1994)。对于氮源，则会优先考虑酵母粉和

核磁共振,组分分布,情况

图 1.3 EPSs 各组分分布情况Fig. 1.3 Different constituents and sub-constituents of EPSs 多糖根据胞间定位的不同，微生物可以合成 3 种不同类型的多糖: 1.类似糖原等物质起储存胞内多糖；2.胞壁多糖，如几丁质和肽聚糖等；3.胞外多糖，包括与细胞相连的荚膜发酵液中多糖，是 EPSs 重要组成部分，含多羟基（2 个或以上）的醛类或酮类化合物(C)。目前，常采用检测方法包括蒽酮-硫酸比色法、苯酚-硫酸比色法、氨基己糖比色测分光光度法，不同测定方法对测定结果影响较大，因此在测量过程中需结合各组分含、可靠性进行综合考虑。多糖结构分析常用的方法有酸水解法、过碘酸氧化、甲基化降解、甲醇解和乙酰解等化学方法和红外光谱、紫外光谱、质谱、核磁共振、气相联用等物理方法，多糖的立体结构一般采用 2D-NMR 及 X 射线衍射法(Ruhmann )。在实验室中，测定多糖分子量最简单实用的方法是凝胶渗透色谱法（GPC），根据同分子量的多糖与洗脱保留时间（tR）成一定关系进行测定。表 1.2 为近年来对丝状糖的结构研究结果，其中以杂多糖居多和部分同多糖，多糖分子量有几千到几十万不

【相似文献】