植物内生菌Salinicola tamaricis F01锰生物氧化机制研究

发布时间：2020-08-02 22:27

【摘要】：Salinicola tamaricis F01是从山东省东营市黄河三角洲生长的柽柳叶片部分分离出来的一株细菌,具有较高二价锰元素抗性。本文通过qRT-PCR、RNA-seq、SEM、XRD、蛋白质分离提取等技术建立了S.tamaricis F01二价锰抗性氧化机制模型,完善了植物内生菌锰生物氧化机制理论。本课题首先通过对S.tamaricis F01全基因组测序结果分析,预测部分锰氧化相关基因,通过qRT-PCR技术检测S.tamaricis F01培养8 h、16 h、24 h、32 h、40 h和48 h后过氧化氢-过氧化物酶等基因表达水平得知,锰结合脂蛋白、主要外膜蛋白、过氧化氢酶、细胞外金属蛋白酶等基因与S.tamaricis F01锰生物氧化相关,同时,根据qRT-PCR结果确定了转录组测序处理时间。在最小影响生长浓度的锰胁迫下,通过分析转录组测序结果揭示了S.tamaricis F01在二价锰胁迫条件下的早期基因表达模式。在二价锰元素胁迫下,编码锰外排泵、三元三羧酸转运蛋白底物结合蛋白、铵转运体、I型分泌的C末端靶向结构域蛋白和细菌铁蛋白等基因表达量显著上调,说明S.tamaricis F01可能通过外排、隔离、氧化和释放铵等物质改变细菌内外部环境,解除二价锰元素对于S.tamaricis F01的毒性。此外,离子转运、氧化还原反应、三羧酸循环、糖类、脂肪酸特别是氨基酸代谢过程有关基因表达发生明显变化,说明S.tamaricis F01通过多种代谢途径的改变来防御非特异性的二价锰元素损伤,或调整整个细菌的代谢水平来适应外界的二价锰元素胁迫。在这个过程中,细菌通过向外排出铵盐、羧酸盐等物质改变了细菌外部环境,为二价金属锰生物氧化提供了前体物质,有利于二价锰元素的生物氧化。部分转录调节因子、分子伴侣和代谢途径关键酶等被二价锰元素诱导表达,说明S.tamaricis F01在二价锰胁迫下细菌的整体调控是复杂而精细的,有助于维持细菌内锰稳态。为了进一步证实S.tamaricis F01的锰氧化分子机制,通过硫酸铵沉淀、透析、离子交换层析、凝胶过滤、超滤法和SDS-PAGE技术分离得到锰(Mn~(2+))处理S.tamaricis F01菌株培养液中的蛋白质,通过锰氧化蛋白样品液锰液孵育与LBB检测法验证条带蛋白质锰氧化功能,通过二级质谱技术检测聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质种类,确定在二价锰元素胁迫下后期主要发挥作用的有过氧化氢-过氧化物酶和鞭毛蛋白同源蛋白质。对两种过氧化氢-过氧化物酶进行SWISS-MODEL同源建模,发现两种过氧化氢-过氧化物酶可能是同源二聚体,配体分子是氧原子。并且努力运用无细胞蛋白质合成系统表达过氧化氢-过氧化物酶基因。运用XRD、SEM技术检测经过不同培养基PYCM、PYCM HEPES、改良PYCM、改良PYCM HEPES、K、K HEPES、NaCl质量体积比为5%的LB、NaCl质量体积比为5%的LB HEPES培养S.tamaricis F01得到的锰氧化物沉淀,确定S.tamaricis F01主要将二价金属锰转化为MnCO_3,同时产生极少量的MnO_2、Mn_2O_3、Mn_3O_4和MnO。并且通过SEM观测S.tamaricis F01形成锰氧化物形态,大量小型球状、杆状、柱状颗粒聚集联结成较大球状、杆状或者柱状物质。本课题还进一步研究了植物内生菌S.tamaricis F01和耐盐碱植物相互作用关系。S.tamaricis F01具有独特的促生抗逆性质,能产生吲哚乙酸、嗜铁素和ACC脱氨酶等促生抗逆物质,但是S.tamaricis F01对于盐地碱蓬株高、根长和重量外部特征没有显著影响,而且无法通过菌液浇灌定殖在盐地碱蓬根部聚集生成锰氧化物膜状覆盖物,这可能与S.tamaricis F01的宿主是柽柳而非盐地碱蓬有关,以致无法通过菌液浇灌定殖构建S.tamaricis F01与盐地碱蓬复合体应用于环境治理,需要进行S.tamaricis F01回接木本柽柳实验。综上,本课题揭示了植物内生菌S.tamaricis F01锰抗性及锰氧化分子机制,为阐明微生物尤其是植物内生菌锰生物氧化机制提供了参考数据,并为植物内生菌环境治理的应用奠定了良好基础。
【学位授予单位】：山东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q935
【图文】：

路线图,研究技术,路线图,锰氧化

山东师范大学硕士学位论文验证锰氧化细菌与植物盐地碱蓬是否普遍存在锰氧化物膜现象，深入研锰污染土壤或者盐碱地中，种植与植物内生菌共生的盐地碱蓬，富集锰除盐地碱蓬，处理植株可消除锰污染，应用 S. tamaricis F01 等锰氧化植于环境治理。同时期望柽柳内生菌 S. tamaricis F01 可与盐地碱蓬共生，作用，更有利于植物内生菌锰氧化作用的发挥，深入研究挖掘 S. tamari氧化富集的环境保护作用[27]。课题是在发现新种 S. tamaricis F01 的基础上，进一步探究细菌的锰氧化入挖掘 S. tamaricis F01 锰氧化相关基因与蛋白质，期望建立整体植物内tamaricis F01 锰氧化机制模型，期望在锰元素化合物工业生产中应用相关白质，建立植物内生菌与植物的复合体应用于环境治理生态保护中，发究的实际应用价值。

流程图,转录组,测序,流程

Mn(Ⅱ)处理时间的确定mmol/L Mn(Ⅱ)的 NaCl 质量体积2 h、40 h、48 h 后，分别提取 RN生物氧化相关的基因，设计引物况。测序处理条件，在 S. tamaricis F4 h 后，在 4℃冰上收集菌体，一引物 PCR 扩增，送铂尚生物有maricis F01 菌株，并且无其他细的样品分别命名为 O1、O2、O3M3，使用液氮速冻样品，置于公司，进行转录组测序实验，进

测序,转录组,文库构建,基因组

山东师范大学硕士学位论文物(random hexamers)合成 cDNA，然后在 DNA 聚合成另一条链 cDNA，末端修复，添加 A 尾，连接测选择片段长短，PCR 扩增，AMPureXPbeads 纯化 P使用 Qubit2.0 检测核酸含量，稀释至 1ng/μL，使用达标后使用 qPCR 方法准确定量，确保文库有效浓度 pooling，进行 HiSeq/MiSeq 测序[28-33]。

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