番茄转录因子SlNAC73基因的克隆以及功能分析

发布时间：2020-08-05 12:57

【摘要】：植物在生长发育过程中经常会遭遇多种逆境胁迫,这些胁迫会抑制植物的代谢活动和生长发育过程,严重时甚至会导致植物死亡。随着全球气候变暖,高温胁迫对植物的影响日益加剧。在高温胁迫下,番茄体内会积累过量的活性氧(reactive oxygen species,ROS),破坏番茄细胞膜系统,影响光合作用等生理过程,进而抑制植株的生理代谢,限制其生长发育。因此,研究番茄响应高温胁迫的机制和分子基础,对提高番茄高温抗性具有重要的科学意义和实践价值。NAC转录因子作为植物所特有的、最大的转录因子家族之一,在植物的生长发育和胁迫响应过程中发挥重要作用。番茄作为重要的蔬菜作物,共包含102个NAC转录因子,其中绝大部分成员的功能未知。我们克隆了番茄中的一个NAC转录因子(SlNAC73),并探讨了其在叶绿素代谢过程中的作用和高温胁迫下的功能。主要的研究结果如下:(1)从番茄中克隆得到SlNAC73(Solyc07g066330.2),该基因全长为1482 bp,包含1029 bp的开放阅读框,编码342个氨基酸,分子量为38.83 kDa,等电点为9.75。(2)将SlNAC73-GFP融合蛋白在拟南芥原生质体中瞬时表达,通过激光共聚焦显微镜观察,发现SlNAC73蛋白定位于细胞核。利用酵母杂交系统,证明SlNAC73具有转录激活活性,并且转录激活区位于氨基酸序列的C端。(3)组织表达分析表明,SlNAC73在根、茎、叶、花、果实和种子中均有表达,其中表达量最高的器官是种子。胁迫处理显示,SlNAC73受高温、低温和多种激素(ABA、MeJA、GA、ET)的诱导。启动子元件分析表明,基因上游含有HSE,LTR,ABRE等多种响应元件。(4)构建SlNAC73基因的真核表达载体,通过叶盘法转化番茄,获得番茄过表达和RNAi株系,并通过PCR和qRT-PCR鉴定、筛选得到阳性株系。(5)正常生长条件下,当SlNAC73表达量上调到一定水平时,番茄叶片会出现过早黄化现象;黄化叶片叶绿素含量降低,光合能力降低。RNAi株系的叶绿素含量和光合速率与野生型番茄无明显差异。(6)高温胁迫下,番茄光合能力降低,叶绿素含量减少,但转基因株系与野生型没有明显差异。这说明SlNAC73可能不参与高温胁迫下的植物光合作用过程和叶绿素代谢途径。(7)高温胁迫下,过表达SlNAC73株系中ROS积累量更多,细胞膜受损更严重,渗透调节物质积累量较少;RNAi沉默株系则表现出相反的情况。这表明过表达SlNAC73降低了番茄的高温抗性。综上所述,SlNAC73作为一个典型的转录因子,可以降低番茄的高温抗性,并且它可能通过参与叶绿素的代谢过程,影响番茄的光合能力。
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q943.2;S641.2
【图文】：

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番茄转录因子 SlNAC73 基因的克隆以及功能分析差异，此外 C 端还具有转录激活活性，能够激活或抑制下游基因表达。（3）NAC 域的每个单体由多个螺旋环绕一个反向平行的 β-折叠构成，它们通过盐桥等作用形有功能的 NAC 蛋白二聚体，二聚体表面富含正电荷，可能与 DNA 的结合相关（Ert al., 2004）。

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图 1-2 NAC 转录因子响应胁迫示意图（Puranik et al., 2012）Fig. 1-2 Schematic of NAC transcription factors in response to stress (Puranik et al., 2012)Shen 等人研究发现，OsNAC2 作为负调控因子，能够降低水稻对盐和干旱的抗并且在开花期间，干旱处理过表达 OsNAC2 株系还会降低水稻的产量（Shen et al., 20实验证明，OsNAC2 可以直接结合植物非生物胁迫和 ABA 信号通路中的两个标志OsLEA3 和 OsSAPK1 的启动子上，从而调节它们的表达。而水稻中另一个 NAC 转子 SNAC3 则可增加水稻对高温、干旱和氧化胁迫的抗性。高温胁迫下，SNAC3 通活并提高活性氧清除酶相关基因的表达，降低 H2O2、MDA 和相对电解质渗漏水平（et al., 2015）。在小麦中，过表达 TaNAC67 能够显著增强植物对干旱、盐和冻害的性，TaNAC67 促进多个非生物胁迫响应基因的表达，并且能改善植物的一些生理（Mao et al., 2014）。在研究番茄时发现， SlNAM1 通过增加渗透调节物质，降低化物含量，减轻细胞膜的氧化损伤程度，从而提高番茄的抗低温能力（Li et al., 201而 JUB1 可以被干旱胁迫诱导表达，并能够激活下游基因 DELLA 和胁迫相关

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图 1-3 被子植物叶绿素合成的分子调控（吴自明等，2008）Fig. 1-3 Molecular regulation of chlorophyll synthesis in angiosperms (Wu et al., 2008)σ-氨基酮戊酸 ALA（Aminolevulinic Acid）的生物合成是叶绿素合成过程中的重成部分，起着主导作用，也是叶绿体合成途径中的限速步骤。从谷氨酸到 ALA 需过三个酶促反应（谷氨酰 tRNA 合成酶，谷氨酸 tRNA 还原酶，谷氨酸-1-半醛转氨酶中谷氨酰 tRNA 还原酶（glutamyl tRNAreductase，GluTR）是关键的酶，该酶由 HEM因编码（吴自明等，2008；张修德等，2016）。GluTR 受原叶绿素酸脂和血红素的调节。研究表明，黑暗条件下，叶绿素合成途径只能进行到原叶绿素酸脂，但是随叶绿素酸脂的积累，ALA 的合成会受到抑制，随着光照的增加，植物体内的原叶酸脂降低，ALA 的合成随着升高。血红素能够抑制 ALA 的生物合成，具体作用是素通过负反馈途径调节 GluTR 的活性。同时，FLU（fluorescent in blue light）蛋白以直接与 GluTR 相互作用，抑制 GluTR 的活性（王平荣等，2009）。在叶绿素合成

【参考文献】