探究卤醇脱卤酶HheC催化过程中四个Loop环的协同构象变化

发布时间：2020-08-06 11:24

【摘要】：卤醇脱卤酶(HHDHs)通过分子内亲核取代机制催化邻卤醇水解转化为环氧化物,也可以接受不同的亲核试剂如CN~-、N_3~-、NO_2~-等催化环氧化物的开环反应,在处理有机卤化物污染物和合成手性药物中间体方面有着极高的研究价值。其中卤醇脱卤酶HheC的活性中心包埋在酶分子内部,由四个Loop片段环绕而成,包括底物结合口袋和卤离子结合位点。先前的研究表明:1.卤离子的释放是催化脱卤反应中的限速步骤;2.Loop3片段为卤离子结合位点区域,在催化过程中对卤离子的结合和释放起到了关键作用,且该过程伴随有构象变化的发生;3.Loop4片段也被证明对催化活性和热稳定性有着显著调控作用。目前对Loop1和Loop2区域并没有进行深入探索,且对整个酶活性中心的构象变化的结构基础也没有具体阐述。本文通过实验手段与计算机技术相结合对酶催化过程中的构象变化和卤离子通道结构动力学进行较为系统研究,从蛋白质柔性变化的角度对上述关键问题进行了阐述。通过丙氨酸扫描找到Loop1和Loop2上对活性影响较大的关键位点D80,I81,F82,P84,F86,T134,W139和L142,其中D80A,I81A,F82A三个突变体无明显活性;其余五个位点突变为丙氨酸后活性均有2倍以上的显著提升。构建关键位点的饱和突变文库并进行活性筛选,结果表明D80,I81,F82三个位点未检测到有明显活性的突变体,表明这三个氨基酸对酶发挥催化功能的重要性;其余五个位点的饱和突变文库中筛选到了活性有不同程度提升的突变体。为了进一步探究构象变化对酶活性的影响,将位于同一Loop环上的关键位点优势突变体进行叠加,得到了一系列酶活性提高6-15倍的叠加优势突变体。通过分子动力学(MD)模拟技术对上述优势突变体的三维结构进行优化,同时对氨基酸之间的相互作用力进行分析。结果表明:关键位点的丙氨酸突变体P84A,F86A,T134A,W139A和L142A以及W139的一系列优势突变体的活性中心柔性增加,推测可能是通过减小残基侧链,使得活性空间变大,且与周围氨基酸的相互作用减弱,有利于蛋白质构象发生改变,进而导致酶的催化活性大大升高。该推断在多个活性提高的叠加突变体中(如P84A-F86A)也得到进一步证明。综上所述,底物结合口袋或者卤离子结合位点处Loop的柔性改变是酶活性升高的主要原因。通过对分子动力学模拟得到卤离子从活性中心释放到溶剂中的运动轨迹进行分析得到了处于不同时刻的Br-位置,得到其周围可能相互作用的氨基酸,并对卤离子的释放通道进行预测。结果发现Loop1区域上的F82-P84位点,Loop3区域上的P175-L178和Y185-Y187位点,Loop4的W249以及F12位点,对卤离子释放起到了关键作用。三维结构的比对也表明,这些位点在卤离子释放前后构象发生了较大改变。由此得出,这些氨基酸可能参与卤离子释放过程中所伴随的构象变化,相关研究可以对后续的卤醇脱卤酶改造奠定了理论基础。
【学位授予单位】：电子科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q814
【图文】：

紫色,三联体,活性部位,卤离子

电子科技大学硕士学位论文留了与 SDRs 家族类似的催化三联体结构 Ser132-Tyr145-Arg149：酪氨酸 Tyr 从底物的羟基中夺取一个质子，底物中的氧原子对临近的卤代碳原子亲核攻击形成环氧化物和卤离子。其中丝氨酸 Ser 通过形成氢键稳定底物，精氨酸 Arg 则可以降低酪氨酸的 pKa值。夺取的质子则通过 Arg、水分子以及酶表面的 80Asp 释放到溶剂中去[13,17,18]，如图 1-1b 所示。卤离子则从底物结合口袋移动至卤离子结合位点，再从结合位点处释放到外部溶剂中去。(a) (b)

示意图,三维结构,位点,氨基酸

p3 和 Loop4 区域关键氨基酸以及 F12 位点与 Cl-结合的三维酶的应用特有的催化性能使其在工业上倍受重视。研究表明卤键断裂的脱卤反应，应用于有毒外源生物的生物1,2,3-三氯丙烷或去除食品加工过程中形成的 3-氯类化合物[22,23]；还能作为催化剂应用于生物催化领-、N3-、NO2-等，催化环氧化物的开环反应来合成代醇等化合物[24]。其中比较重要的无疑是合成 Lipit主要活性成分为阿托伐他汀）的活性中间体 R-4-氰映如图 1-3 所示：第一步是利用酮还原酶（KRED乙酸生成 S-4-氯-3-羟基丁酸；第二步是利用卤醇脱度下与 HCN 反应，催化氰基取代氯取代基。天然不足以满足大规模应用，因此对卤醇脱卤酶的催化

序列,阿托伐他汀,活性中间体,氰基

图 1-3 阿托伐他汀的活性中间体 R-4-氰基-3-羟基丁酸酯的合成反应，其中括号内代表阿托伐他汀的结构式1.3 卤醇脱卤酶 HheC 的改造为了使卤醇脱卤酶 HheC 更好地应用于工业生产，需要对其酶活性进行改造。酶工程是当今生物技术领域的重要组成部分，随着基因工程和蛋白质工程的崛起，对酶的改造也开始变得多样化。运用基因工程可以通过增加编码该酶质粒的拷贝数，启动子工程等来提高微生物的产酶量，这一原理也已成功地应用于解决酶效率低下的问题[5]。然而这些策略并不能克服酶本身的缺陷，蛋白质工程的出现很大程度上解决了这一问题。蛋白质工程的目的是通过改变蛋白质的序列从而改变其结构，创造出具有更好的功能特性的酶，如稳定性、活性、反应产物的抑制作用以及对非天然底物的选择性。例如在以酶的固定化为核心的发酵工程中，人们对酶自身的特点研究后发现，通过对酶做一些细微的改变，可以使酶在保持原有的优良特性的前提下，更加符合工业生产应用，如生产出稳定性极强、耐高温的酶[2,3,5,28]。在起始阶段，主要采用定点突变技术对酶进行改造。如 Shanklin 发现通过对不饱和

【相似文献】