表达PD-1单克隆抗体的新型溶瘤性单纯疱疹病毒的构建及其抗肿瘤疗效的研究

发布时间：2020-08-06 12:14

【摘要】：研究背景免疫检查点阻滞剂的应用是肿瘤治疗领域的一大突破,它已在多种肿瘤类型中取得了令人振奋的临床疗效。目前,美国食品药品监督管理局已经批准6种靶向CTLA-4、PD-1或PD-L1的单克隆抗体用于12种临床肿瘤指征。不幸的是,只有10-40%的肿瘤患者能从中获益。PD-1/PD-L1阻滞疗效不佳通常可归因于肿瘤微环境内浸润淋巴细胞有限。溶瘤病毒代表另外一种新兴的肿瘤免疫疗法,它主要通过选择性的裂解肿瘤细胞导致其发生免疫原性死亡,释放大量的肿瘤相关抗原、病原相关分子模式和损伤相关分子模式,从而促进抗原提呈,募集T细胞,使T细胞致敏。此外,溶瘤病毒引起的Ⅰ型干扰素反应,亦可产生趋化因子,募集周围的T细胞。基于免疫检查点阻滞剂和溶瘤病毒治疗不同的作用机制,我们探讨了二者联合使用的新策略及其是否可以产生协同的抗肿瘤效应。方法我们首先利用分子克隆和同源重组技术构建了表达抗人PD-1单克隆抗体的新型溶瘤性Ⅱ型单纯疱疹病毒(oHSV2-aPD1)。应用蛋白免疫印迹和共培养实验,我们检测了 oHSV2-aPD1病毒产生PD-1单抗的能力及表达的PD-1单抗的生物学功能。通过病毒感染实验和CCK8细胞增殖实验,我们比较了未经抗体修饰的亲代溶瘤病毒oHSV2和表达抗人PD-1单抗的子代病毒oHSV2-aPD1的感染能力及体外溶瘤活性。应用B16R小鼠黑色素瘤模型,我们探讨了 oHSV2-aPD1病毒的体内抗肿瘤效果。此外,利用流式细胞术和转录组测序技术,我们进一步探索了 oHSV2-aPD1病毒疗法对肿瘤微环境和机体系统免疫状态的影响。结果(1)我们成功构建了表达抗人PD-1单克隆抗体的新型溶瘤性Ⅱ型单纯疱疹病毒,oHSV2-aPD1。(2)通过感染真核细胞,oHSV2-aPD1病毒表达出了分子量大小正确的抗人PD-1单克隆抗体,该抗体能识别人源PD-1抗原并与之结合,活化T细胞,促进细胞因子IFN-y和IL-2的合成。(3)oHSV2-aPD1病毒同亲代病毒oHSV2相比,溶瘤谱未发生改变,溶瘤活性亦未被削弱。(4)在小鼠B16R黑色素瘤模型中,oHSV2-aPD1病毒疗法获得了与联合治疗(局部应用oHSV2病毒+系统应用抗人PD-1单抗)相似的抗肿瘤效果,并且这种疗效无论是在抑制肿瘤生长还是延长小鼠生存期方面,都优于单独治疗(单独oHSV2或抗人PD-1单抗治疗)。(5)oHSV2-aPD1病毒治疗激活了机体肿瘤微环境和外周免疫系统内大量的免疫效应细胞和分子,并且减少了免疫抑制性细胞的比例。(6)机体外周免疫状态与肿瘤微环境内免疫状态相比,与肿瘤免疫治疗疗效有更好的相关性。结论我们的研究表明,oHSV2-aPD1病毒疗法在临床前动物肿瘤模型中展现出了良好的抗肿瘤活性和持久的疗效反应,提示表达免疫检查点阻滞剂的溶瘤病毒在肿瘤临床治疗中具有很大潜力。
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q78;R730.51
【图文】：

序列,基因组分,线性质粒,穿梭质粒

逑大小为６２９３邋５？，大于空载质粒？１１０５２（１３４．５邋（分子量为４４９９邋５？），所以挑选的１－７逡逑号和９－１２号克隆均可能为正确的ｐＨＧ５２ｄ３４．５－ＣＭＶ－ｅＧＦＰ质粒（图３ａ），我们选择逡逑１－４号克隆进行后续酶切鉴定。成功的顺式连接质粒ｐＨＧ５２ｄ３４．５－ＣＭＶ－ｅＧＦＰ经ＥｃｏＲ逡逑Ｉ和Ａｇｅ邋Ｉ内切酶双酶切为５５６５邋ｂｐ和７２８邋ｂｐ两个片段；成功的反式连接质粒逡逑ｐＨＧ５２ｄ３４．５－ＣＭＶ－ｅＧＦＰ邋经邋ＥｃｏＲ邋Ｉ邋和邋Ａｇｅ邋Ｉ邋双酶切为邋５２０３邋ｂｐ邋和邋１０９０邋ｂｐ邋两片段，所逡逑以１号和３号克隆可能为正确的顺式连接ｐＨＧ５２ｄ３４．５－ＣＭＶ－ｅＧＦＰ质粒（图３ｂ）。逡逑经一代测序验证，１号克隆序列正确且无碱基突变，我们将其作为阳性克隆进行扩逡逑增，获得了邋ｐＨＧ５２ｄ３４．５－ＣＭＶ－ｅＧＦＰ邋质粒。逡逑接下来我们利用ＤＮＡｚｏｌ试剂提取了邋0ＨＳＶ２病毒基因组，然后利用磷酸钙微逡逑沉淀转染法，将0ＨＳＶ２病毒基因组和穿梭质粒ＰＨＧ５２ｄ３４．５－ＣＭＶ－ｅＧＦＰ共同转染进逡逑入病毒生产细胞。0ＨＳＶ２病毒在复制过程中，约有十万分之一的概率与ｐＨＧ５２ｄ３４．５－逡逑ＣＭＶ－ｅＧＦＰ质粒发生同源重组，从而使ＣＭＶ－ｅＧＦＰ表达序列替换掉ｏＨＳＶ２病毒基逡逑因组中ＩＣＰ３４．５基因表达序列

病毒,同源重组,线性质粒

入病毒生产细胞。0ＨＳＶ２病毒在复制过程中，约有十万分之一的概率与ｐＨＧ５２ｄ３４．５－逡逑ＣＭＶ－ｅＧＦＰ质粒发生同源重组，从而使ＣＭＶ－ｅＧＦＰ表达序列替换掉ｏＨＳＶ２病毒基逡逑因组中ＩＣＰ３４．５基因表达序列，得到少量的ｏＨＳＶ２－ｅＧＦＰ（ＩＣＰ３４．５位）病毒（图４）。逡逑通过在荧光显微镜下进行多轮的挑选纯化，最终获得无0ＨＳＶ２病毒混杂的ＯＨＳＶ２－逡逑ｅＧＦＰ邋（ＩＣＰ３４．５邋位）纯病毒。逡逑ｆｍｍｍ逦ＨＩ逡逑■逦■逡逑图３穿梭质粒ｐＨＧ５２ｄ３４．５－ＣＭＶ－ｅＧＦＰ的构建逡逑（ａ）线性质粒ｐＨＧ５２ｄ３４．５与ＣＭＶ－ｅＧＦＰ片段连接产物的基因组分子量分析。Ｌａｎｅ邋Ｍ２：挑选逡逑的卜１２号克隆；Ｎ：阴性质控，环形质粒ｐＨＧ５２ｄ３４．５。（ｂ）线性质粒ｐＨＧ５２ｄ３４．５与ＣＭＶ－ｅＧＦＰ逡逑片段连接产物的酶切鉴定。Ｌａｎｅ邋１－４：挑选的１－４号克隆经ＥｃｏＲ邋Ｉ和Ａｇｅ邋Ｉ双酶切产物；Ｎ１、逡逑Ｎ２：邋ＥｃｏＲＩ单酶切载体质粒ｐＨＧ５２ｄ３４．５产物。Ｍ：邋ＤＮＡ分子量标准，从上到下电泳条带分子逡逑量依次为邋１０、８、６、５、４、３、２、１、０．８、０．５邋和邋０．３邋ｋｂ。逡逑４４逡逑

示意图,病毒,示意图,序列

逑（图７），一代测序结果证明序列正确且无碱基突变。至此，我们成功构建了邋0ＨＳＶ２－逡逑ａＰＤｌ病毒，图８所示即为病毒构建总体示意图。逡逑Ｐｈａｓｅ逦－逦Ｉ：逡逑图６同源重组成功的ｏＨＳＶ２－ａＰＤｌ病毒形成的噬毒斑（２０0ｘ）逡逑图７邋ｏＨＳＶ２－ａＰＤｌ病毒抗体基因修饰序列的ＤＮＡ梯度分析逡逑Ｌａｎｅ邋１：空白对照，以Ｈ２０为模板扩增的轻链序列；Ｌａｎｅ邋２：空白对照，以Ｈ２０为模板扩增的逡逑重链序列；Ｌａｎｅ３：阴性对照，以０ＨＳＶ２为模板扩增的轻链序列；Ｌａｎｅ４：阴性对照，以ＯＨＳＶ２逡逑为模板扩增的重链序列；Ｌａｎｅ５：以ｏＨＳＶ２－ａＰＤｌ为模板扩增的轻链序列；Ｌａｎｅ６：以ＯＨＳＶ２－逡逑ａＰＤｌ为模板扩增的重链序列。逡逑４７逡逑

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