圆盘菌科真菌MAT基因结构、进化及其功能的初步研究

发布时间：2020-08-06 12:17

【摘要】：生殖是生物最基本的特征之一,是生物适应与进化的基础。生物的生殖包括两种方式,即无性生殖(asexual reproduction)与有性生殖(sexual reproduction)。而在真菌中,由于存在着极其多样化的生殖特征,现在已成为研究的热点,目前有关有性生殖进化和维持机制方面的研究知之甚少,相关物种的生殖模式、发生有性生殖的机制和相关信号通路、诱导有性生殖的内在和环境因素等,也一直是一个悬而未决的问题。因兼具多种生殖模式,圆盘菌科真菌已经成为了研究真菌有性生殖机制的理想模型。在课题组分离和保存了圆盘菌科多种能进行有性生殖模式个体的基础上,本论文拟以交配型基因为靶标,通过对交配型基因的结构、进化和基因功能进行初步研究,旨在为理解圆盘菌科真菌有性生殖的进化和生态适应提供有价值的线索。主要研究结果如下:1.对包括圆盘菌科六个代表属节丛孢属(Arthrobotrys)、小德氏霉属(Drechslerella)、亚隔指孢属(Dactylellina)、隔指孢属(Dactylella)、双头盘菌属(Dicranidion)、圆盘菌属(Orbilia),15株菌进行了全基因组重测序、经组装和分析后注释了所有测序真菌的交配型基因位点(mating type locus),交配型基因大小在1445～4378 bp,编码434～1142个氨基酸,内含子1-7个不等,确认同宗配合真菌两种,异宗配合真菌两种。2.对交配型基因序列进行了种间和种内差异性分析,发现交配型基因一级结构在种内是保守的,在种间随着物种的不同存在显著差异。通过对交配型基因位点的结构分析,发现交配型基因上游相对保守,而下游基因却存在着大量的易位和倒置;并对不同物种交配型基因二级和三级结构进行预测,发现其存在保守的二、三级结构,编码相同的蛋白质家族HMG-domain,即MAT1-2交配型位点的核心蛋白;更进一步的选择压力分析显示,交配型基因受到的选择压力远远大于看家基因,在不同生殖模式中,两种交配型基因受到的选择压力各不相同,MAT1-2基因在同宗配合真菌中受到的选择压力是远远大于异宗配合真菌,MAT1-1基因在不同生殖模式中受到的选择压力相同;基于上述研究结果我们支持“交配型基因MAT1-1是由MAT1-2进化而来”这一假说。系统发育研究展示了交配型基因和核基因具有不同的系统发育树拓扑结构,表明交配型基因和看家基因有着较大程度的分化,极有可能是交配基因受到更大的选择压力影响导致,这种系统发育拓扑结构上的差异在座囊菌纲(Dothideomycetes)和锤舌菌纲(Leotiomycetes)极为明显。3.以A.oligospora为研究对象,基于全国范围内采集的96株菌,分别扩增了 MAT1-1、MAT1-2、ITS、RPB2、β-tub五个基因,其中扩增出 MAT1-1 菌株47株,MA"H-2菌株49株,比例接近1:1,存在有性生殖的可能,并按照MAT1-1和MAT1-2基因的不同将所有菌株分为两个类群,进行了群体遗传学的分析,利用单基因构树和多基因联合构树发现 A.oligospora分为三个支系,与之前的研究相同,存在明显种内分化,单基因和多基因联合构树显示样品的聚类和地理分布关系不大,STRUCTURE分析得知MAT1-1类群分为四个群体结构,而MAT1-2类群分为两个群体结构,整个A.oligospora类群存在种群分化;两个类群群体贡献均为种群内部变异的贡献大于种群间贡献,存在群体间的基因流,连锁不平衡分析和系统发育不相容分析表明,在种群内部存在随机重组,基于上述研究,多证据表明A.oligospoA 种群内部极可能存在有性生殖,随后我们用多种培养基在不同条件下进行了该类真菌有性生殖的诱导,并未成功诱导出其有性生殖结构,通过测序检测也并未发现重组,但是对不同诱导时期的样品提取RNA后进行MAT1-1基因的cDNA扩增,发现该基因的转录,暗示着该类真菌的有性生殖还受到其他多种因素的控制。4.为了进一步的研究交配基因是否参与菌丝的生长、孢子的发育或具备其他生物学功能,我们以尿嘧啶缺陷型酿酒酵母为载体细胞,通过电转的方法成功构建了A.oligosp A 两个交配型基因的敲除载体,并以CaC12-PEG介导的方法成功获得了A.oliospora △MAT1-1敲除株,分别比较了野生型和敲除株的生长速率、抗逆性、孢子形态及数量和产捕器能力,实验结果表明,在生长速率和产捕器能力上野生型和敲除株无明显差异,但是在孢子的形态、数量和抗逆性上具有统计学上意义,表明该基因可能影响着该科真菌的无性生活史。
【学位授予单位】：云南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q935
【图文】：

云南大学硕士学位论文逦逡逑制；由两个独立遗传因子控制的交配称为四极性交配系统，由信息素和其受体逡逑基因和编码转录因子的ｂ基因控制。人类致病担子菌新隐球菌（ＣＶ＾ｐｒｏｃｏｃｃｗｓ逡逑ｏ／ｏｍｗｗ）信息素和其受体都存在于两个相反的交配型菌株中，因此我们认为在逡逑子菌中，同宗配合真菌和异宗配合真菌都同时含有信息素和其受体［１２，２６，２７］。逡逑ａｔｉｎｇ邋ｔｙｐｅ邋ｌｏｃｕｓ是控制子囊菌和担子菌有性生殖的重要基因调控位点，但并不逡逑所有真菌都存在这一调控系统，接合菌门中，更小的一种有机分子三孢子酸作逡逑信息素，完全不同于子囊菌和担子菌中的信号肽，在壶菌纲中，涉及到的是一逡逑列化学物质，如异水霉雌性菌株产生雌激素，雄性菌株逡逑生雄激素［２８］。逡逑ｍａｔｉｎｇ，邋ｔｙｐｅ邋１逦ｍａｔｉｎｇ邋ｔｙｐｅ邋２逡逑

产其他捕器的真菌与不产捕器的真菌分别聚类在一起形成两个独立的支系。逡逑ｌｒ＞ｃｉｎ邋ｔ0ｅ？？Ｋ＊ｒ逦Ｃｒ＊？？？邋Ｔｒａｃｋ邋ｌ－ｉ＊？逡逑ＪＯ逦２？０邋０Ｃ０逦２Ｓ０．０９Ｃ逦３９０．００Ｓ逦ＳＳＣ．９ＳＣ逦－ｔＱＣ邋＆ａＣ逦４Ｅ０Ａ０Ｃ逦５Ｓ８．００Ｓ逡逑Ｉ逦Ｉ逦Ｉ逦V逦Ｉ逦Ｉ逦Ｉ逡逑２？４Ｓ＿Ｍ７Ｌ邋５７０ＭＸＸ＿Ｌ邋１＿１．逡逑Ｔ４0．ＳＣｉ邋ｆ？＊０？逡逑？？＊－？邋？？？＜＞＞邋？？？＊，》＞？＊邋、ｖ．？邋？＊＞．？逦ｔｖｔ＊逡逑ａ？？ＡＭｉ逦＞？0．？0？逦ｚｒｓ＾ｅｅ逦？？ｅ邋ｓｅｅ逦ａ？？ａ＊ｅ逦？ｔ0ｊ＞ｅ？逦ｕｓａｏｏ逦？ａ？．９９ｅ逡逑＜逦ｉ逦＜逦ｔ逦ｉ逦ｘ逦ｉ逦？逦＜逡逑？Ｔ４＊．ｗｎ．？．？ｏｔ？ｅｘ＊．．？■＞．？逡逑图邋２＿１：邋Ｒｅａｄｓ邋的邋Ｍａｐｐｉｎｇ邋组装逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－１：邋Ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ邋ｒｅａｄｓ逡逑Ｋ邋ｍａｒ邋ｌ＇ｒ？＾ｕｔ！Ｆ？４Ｃｙ邋Ｏ邋？？邋ｊｆｃ？Ｍｉｊｎｎ逡逑？９邋丨邋＂＂邋；邋．■■■■ｆｌ．￣．－—ｙ■一邋．广．邋－？邋．■…．＞■—邋－．邋逡逑

２．邋２交配基因的检索与分析逡逑基于基因组和真菌交配型基因的结构特征，我们通过本地Ｂｌａｓｔ进行本地检逡逑索，找到交配型基因可能存在的Ｓｃａｆｆｏｌｄ，并对Ｓｃａｆｆｏｌｄ进行了基因预测，预测逡逑出的基因在在线数据库进行比对查找，ＮＣＢＩ数据库中导入对应氨基酸序列，能逡逑够检索出真菌交配型基因词条，并能检索出相应蛋白保守结构域，在ＥＢＩ数据库逡逑Ｉｎｔｅｒｐｒｏｓｃａｎ邋（非冗余蛋白）进行检索，能够得到注释信息为ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ家族的逡逑Ａｌｐｈａ－ｂｏｘ邋和邋ＨＭＧ－ｂｏｘ邋的注释结果，如图邋２－４、２－５0逡逑基于基因预测和数据库比对后，我们确定了所有重测序菌株的交配型基因，逡逑其中在两株不同的Ａ邋ｏ／／ｇａｓｐｏｒａ、ＩＶ．逦菌株中分别发现了邋ＭＡＴ１－１和逡逑ＭＡＴ］－２，在两个菌株ＯＭ／ｆｌｓｐ．中同时发现ＭＡＴ１－１和ＭＡＴ１－２，确定了圆盘菌逡逑科三种真菌的交配类型，在剩余的６个物种内由于菌株数量有限，只发现了其中逡逑一种交配型基因。最小的交配型基因是存在于Ｚ）／ｃｒａ？／＜ｉ／ｏ？７邋ｓｐ．邋ＹＭＦ１．０３０２４中的逡逑ＭＡＴ１－１有４３４个氨基酸，存在两个内含子；最大的交配型基因是Ａｏ／／ｇ（ｗｐ0７－0逡逑

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本文编号：2782388