含腈水合酶重组大肠杆菌的固定化
发布时间：2020-08-07 18:46
【摘要】：含腈水合酶的细胞能够催化腈水合反应生产酰胺,具有重要的工业用途。但游离细胞在催化过程中容易失活,破裂的细胞影响产品的分离纯化。固定化细胞技术能有效的解决这些问题。但目前已报道的含腈水合酶固定化细胞稳定性普遍较低,或固定化过程中存在一定的毒性,对细胞伤害较大。为解决上述问题,本研究开展含腈水合酶重组大肠杆菌的固定化研究,选择3-氰基吡啶水合生成烟酰胺作为模型反应,主要结果如下:(1)比较了海藻酸钙、聚丙烯酰胺、卡拉胶、琼脂和DA-F127水凝胶等固定化方法,考察固定化过程的酶活回收率和固定化细胞的批次反应情况。筛选得到两种效果较好的固定化方法,即海藻酸钙固定化法和DA-F127水凝胶固定化法。其中海藻酸钙固定化细胞的酶活回收率达到48.08%,DA-F127水凝胶固定化细胞的酶活回收率达到61.28%。两种固定化细胞均可重复使用3个批次以上,酶活损失较小。(2)对海藻酸钙法进行固定化条件优化。确定固定化的最佳条件为:海藻酸钠浓度为3%,氯化钙浓度为3%,细胞添加量为17.5mg/g载体,优化后海藻酸钙固定化细胞的酶活回收率达到56.73%。确定了固定化细胞最适反应pH为7.0,最适反应温度为18℃。研究了固定化细胞催化生产烟酰胺的反应工艺,确定了最优条件,最优条件下的海藻酸钙固定化细胞可催化150 g/L的3-氰基吡啶完成6个批次的转化,与游离细胞催化过程相比,单位质量菌体的烟酰胺产量提高了 4.91倍。(3)对DA-F127水凝胶法进行固定化条件优化,确定固定化的最佳条件为:DA-F127浓度为15%,UV光照射距离为20 cm、光照时间6 min,菌体包埋量为20 mg/g载体,优化后的固定化细胞酶活回收率为89.74%。确定了固定化细胞最适反应pH为7.0,最适反应温度为18℃对DA-F127固定化细胞催化生产烟酰胺进行初步研究,最优条件下的DA-F127固定化细胞可催化150 g/L的3-氰基吡啶完成至少9个批次的转化。与游离细胞催化过程相比,单位质量菌体的烟酰胺产量提高了 12倍。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q814.2
【图文】：
Ｏｕｔｅｒ－ｓｐｈｅｒｅ邋ｍｅｃｈａｎｉｓｍ；（ｃ）邋Ｓｅｃｏｎｄ邋ｏｕｔｅｒｓｐｈｅｒｅ邋ｍｅｃｈａｎｉｓｍ逡逑腈水合酶催化机理较为复杂，目前受到人们普遍认可的是Ｎｅｌｓｏｎ等提出的逡逑三种催化机理，如图１．４所示。（ａ）内球机制：腈水合酶活性中心的金属离子与逡逑底物的腈基形成配体，接着水分子与ＣＴ发生亲电加成，生成不稳定中间体，随逡逑后中间体发生分子重排生成酰胺。（ｂ）外球机制：酶活中心羟基中的氧原子与底逡逑物腈基的碳原子发生亲核加成生成中间体，中间体经过分子重排生成酰胺。（ｃ）逡逑第二外球机制：腈水合酶的一个残基处于氧化状态，与水分子结合，水分子被活逡逑性中心激活
第一章文献综述逡逑ＤＡ－Ｆ１２７是Ｆ１２７水溶液经由丙烯酰氯酯化接枝生成。再经紫外光照射即可逡逑在短时间内形成水凝胶［７７］。凝胶形成过程如图１．５所示。Ｆ１２７的ＰＥＯ嵌段顶端逡逑与丙烯酰氯酯化生成ＤＡ－Ｆ１２７，在水溶液中ＤＡ－Ｆ１２７形成胶束，亲水外壳是含逡逑丙烯酰基的ＰＥＯ基团，加入光引发剂后，在紫外光的照射下，碳碳双键发生聚逡逑合反应形成牢固的水凝胶［７８］。逡逑图１．５邋ＤＡ－Ｆ１２７水凝胶成胶过程原理图［７９１逡逑Ｆｉｇ邋１．５邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｏｆ邋ＤＡ－Ｆ１２７邋ｈｙｄｒｏｇｅｌ邋ｇｅｌａｔｉｏｎ邋ｐｒｏｃｅｓｓ逡逑为进一步了解ＤＡ－Ｆ１２７水凝胶的成胶效果，Ｓｏｓｎｉｋ等将交联后的凝肢冻干，逡逑通过电镜观察冻干ＤＡ－Ｆ１２７水凝胶的内部结构，如图１．６所示［８（）］。逡逑■逡逑图１．６邋９ｗｔ％浓度ＤＡ－Ｆ１２７在ＵＶ光照下２０ｍｉｎ内显烎结构＿逡逑Ｆｉｇ邋１．６邋Ｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋９ｗｔ％邋ＤＡ－Ｆ１２７邋ｗｉｔｈ邋ｉｎ邋２０邋ｍｉｎ邋ｕｎｄｅｒ邋ＵＶ邋ｌｉｇｈｔ逡逑ＤＡ－Ｆ１２７浓度影响水凝胶成胶孔径和壁厚。Ｌｅｅ等制备了不同ＤＡ－Ｆ１２７浓逡逑度的水凝胶，冻干后，通过电镜观察水凝胶的交联形态，得到凝胶的孔径和壁厚逡逑与ＤＡ－Ｆ１２７浓度关系如表１．５所示。随着ＤＡ－Ｆ１２７浓度的增加，ＤＡ－Ｆ１２７水凝逡逑胶的孔径增加，壁厚也有所增加。他们据此推测，在高浓度ＤＡ－Ｆ１２７中，形成逡逑１２逡逑
的胶束在光交联反应前处于高拥挤状态，交联形成的水凝胶产生较大空隙。而在逡逑低浓度溶液中，反应形成的水凝胶空隙较小，水凝胶壁厚更薄。不同浓度ＤＡ－Ｆ１２７逡逑水凝胶电镜结构图如图１．７所示。逡逑表１．５不同浓度ＤＡ－Ｆ１２７在２５邋°Ｃ经紫外光照射５邋１１１丨１１成胶形态［８１］逡逑Ｔａｂｌｅ邋１．５邋Ｃｈａｎｇｅｓ邋ｉｎ邋ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｏｆ邋ＤＡ－Ｆ１２７邋ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ邋ｐｒｅｐａｒｅｄ邋２５邋°Ｃ邋ｂｙ邋ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ逡逑ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ邋ｗｉｔｈ邋５邋ｍｉｎ邋ＵＶ邋ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ逡逑Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ邋（ｗｔ％）逦Ｐｏｒｅ邋ｄｉａｍｅｔｅｒ邋（ｐｍ）逦Ｗａｌｌ邋ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ邋（｜ｉｍ）逡逑９逦５．５邋±邋１．６逦１．３邋±０．４逡逑１３逦１０．０邋±２．４逦２．２邋±邋１．０逡逑逦１７逦１１．８邋土邋２．５逦５．２邋±２．６逦逡逑Ｕｎｐａｃｋｅｄ邋ｍｉｃｅｌｌｅｓ逦＾逡逑ａｔ９ｗｔ％逡逑费；
本文编号：2784377
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q814.2
【图文】：
Ｏｕｔｅｒ－ｓｐｈｅｒｅ邋ｍｅｃｈａｎｉｓｍ；（ｃ）邋Ｓｅｃｏｎｄ邋ｏｕｔｅｒｓｐｈｅｒｅ邋ｍｅｃｈａｎｉｓｍ逡逑腈水合酶催化机理较为复杂，目前受到人们普遍认可的是Ｎｅｌｓｏｎ等提出的逡逑三种催化机理，如图１．４所示。（ａ）内球机制：腈水合酶活性中心的金属离子与逡逑底物的腈基形成配体，接着水分子与ＣＴ发生亲电加成，生成不稳定中间体，随逡逑后中间体发生分子重排生成酰胺。（ｂ）外球机制：酶活中心羟基中的氧原子与底逡逑物腈基的碳原子发生亲核加成生成中间体，中间体经过分子重排生成酰胺。（ｃ）逡逑第二外球机制：腈水合酶的一个残基处于氧化状态，与水分子结合，水分子被活逡逑性中心激活
第一章文献综述逡逑ＤＡ－Ｆ１２７是Ｆ１２７水溶液经由丙烯酰氯酯化接枝生成。再经紫外光照射即可逡逑在短时间内形成水凝胶［７７］。凝胶形成过程如图１．５所示。Ｆ１２７的ＰＥＯ嵌段顶端逡逑与丙烯酰氯酯化生成ＤＡ－Ｆ１２７，在水溶液中ＤＡ－Ｆ１２７形成胶束，亲水外壳是含逡逑丙烯酰基的ＰＥＯ基团，加入光引发剂后，在紫外光的照射下，碳碳双键发生聚逡逑合反应形成牢固的水凝胶［７８］。逡逑图１．５邋ＤＡ－Ｆ１２７水凝胶成胶过程原理图［７９１逡逑Ｆｉｇ邋１．５邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｏｆ邋ＤＡ－Ｆ１２７邋ｈｙｄｒｏｇｅｌ邋ｇｅｌａｔｉｏｎ邋ｐｒｏｃｅｓｓ逡逑为进一步了解ＤＡ－Ｆ１２７水凝胶的成胶效果，Ｓｏｓｎｉｋ等将交联后的凝肢冻干，逡逑通过电镜观察冻干ＤＡ－Ｆ１２７水凝胶的内部结构，如图１．６所示［８（）］。逡逑■逡逑图１．６邋９ｗｔ％浓度ＤＡ－Ｆ１２７在ＵＶ光照下２０ｍｉｎ内显烎结构＿逡逑Ｆｉｇ邋１．６邋Ｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋９ｗｔ％邋ＤＡ－Ｆ１２７邋ｗｉｔｈ邋ｉｎ邋２０邋ｍｉｎ邋ｕｎｄｅｒ邋ＵＶ邋ｌｉｇｈｔ逡逑ＤＡ－Ｆ１２７浓度影响水凝胶成胶孔径和壁厚。Ｌｅｅ等制备了不同ＤＡ－Ｆ１２７浓逡逑度的水凝胶，冻干后，通过电镜观察水凝胶的交联形态，得到凝胶的孔径和壁厚逡逑与ＤＡ－Ｆ１２７浓度关系如表１．５所示。随着ＤＡ－Ｆ１２７浓度的增加，ＤＡ－Ｆ１２７水凝逡逑胶的孔径增加，壁厚也有所增加。他们据此推测，在高浓度ＤＡ－Ｆ１２７中，形成逡逑１２逡逑
的胶束在光交联反应前处于高拥挤状态，交联形成的水凝胶产生较大空隙。而在逡逑低浓度溶液中，反应形成的水凝胶空隙较小，水凝胶壁厚更薄。不同浓度ＤＡ－Ｆ１２７逡逑水凝胶电镜结构图如图１．７所示。逡逑表１．５不同浓度ＤＡ－Ｆ１２７在２５邋°Ｃ经紫外光照射５邋１１１丨１１成胶形态［８１］逡逑Ｔａｂｌｅ邋１．５邋Ｃｈａｎｇｅｓ邋ｉｎ邋ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｏｆ邋ＤＡ－Ｆ１２７邋ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ邋ｐｒｅｐａｒｅｄ邋２５邋°Ｃ邋ｂｙ邋ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ逡逑ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ邋ｗｉｔｈ邋５邋ｍｉｎ邋ＵＶ邋ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ逡逑Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ邋（ｗｔ％）逦Ｐｏｒｅ邋ｄｉａｍｅｔｅｒ邋（ｐｍ）逦Ｗａｌｌ邋ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ邋（｜ｉｍ）逡逑９逦５．５邋±邋１．６逦１．３邋±０．４逡逑１３逦１０．０邋±２．４逦２．２邋±邋１．０逡逑逦１７逦１１．８邋土邋２．５逦５．２邋±２．６逦逡逑Ｕｎｐａｃｋｅｄ邋ｍｉｃｅｌｌｅｓ逦＾逡逑ａｔ９ｗｔ％逡逑费；
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