三萜合酶和倍半萜合酶元件的挖掘与鉴定

发布时间：2020-08-08 20:22

【摘要】：萜类化合物是广泛存在于植物中的一大类天然产物,其结构复杂,功能多样,不仅在植物与环境的互作中发挥着重要功能,许多还被应用于药物、香水、调料和工业原料等领域。近年来,随着合成生物学和生物信息学等学科的发展,萜类化合物的合成途径研究日趋完善,相关酶的挖掘与鉴定也成为研究热点。萜类化合物的共同前体异戊烯基二磷酸(isopentenyl diphosphate,IPP)及其异构体二甲基丙烯基二磷酸(dimethylallyl diphosphate,DMAPP)在异戊烯转移酶的作用下生成不同的萜类前体,进一步由萜烯合酶催化形成不同的萜类骨架,如单萜(C_(10))、倍半萜(C_(15))、二萜(C_(20))、二倍半萜(C_(25))和三萜(C_(30))等。传统的萜类化合物分离方法是直接从植物中进行分离提取,然而许多萜类化合物在植物中含量很低或其合成受到植物的生长和环境影响很大,所以应用传统方法来发现新的萜类骨架化合物已经越来越困难。在萜类化合物的生物合成途径中,萜烯合酶通过催化前体的环化反应从而形成结构多样的核心骨架,为萜类化合物结构的多样性奠定基础。因此,对植物基因组编码的萜烯合酶进行功能表征,可以为系统挖掘植物中的萜类骨架化合物提供新方法和手段。通过合成生物学的技术对酵母底盘细胞的萜类合成前体途径进行强化,可以为萜烯合酶的系统挖掘和鉴定提供所需的底盘。再结合植物基因组注释分析系统的整理并挖掘植物编码的所有萜烯合酶,导入到萜类底盘细胞进行产物分析与功能鉴定。这种“即插即用”的萜烯合酶功能鉴定方法,为发现新的萜类化合物骨架提供了新的机遇。本文通过搜集已功能鉴定的三萜合酶元件并进行序列与功能的关联分析,发现三萜合酶在进化关系上相对保守,氨基酸序列的相似性较高,以粮食农作物玉米为例,初步建立挖掘三萜合酶元件的方法,找到两个三萜合酶候选基因,经高效液相色谱(HPLC)检测产物不同于课题组已有的三萜化合物,需要做进一步的结构鉴定。通过核磁和质谱分析鉴定出zea3-2化合物的结构为simiarenol。本文首次在玉米中鉴定到simiarenol且挖掘到三萜合酶,为将来利用合成生物学技术来大量合成simiarenol提供了必须的元件,并证实了此挖掘方法的优势,有助于挖掘新功能的三萜合酶。通过搜集已功能鉴定的倍半萜合酶元件,发现序列与功能间联系不紧密,因此进一步搜集单萜合酶、二萜合酶元件,与三萜合酶和倍半萜合酶元件一起构建进化树,分析倍半萜合酶在萜烯合酶中的进化关系。发现其在萜烯合酶进化树中与单萜合酶和二萜合酶之间能分簇,但簇间有交叉,说明可以通过功能簇分类初步界定倍半萜合酶,再从每个OTU中选择代表序列进行克隆表达鉴定。以三七为例,已克隆到分属于5个功能簇的10个OTU的代表序列,将其中7个OTU的代表序列导入倍半萜酵母底盘细胞中进行了表达,但是Western blot分析表明这些序列在酵母底盘细胞中都没有表达或者表达很弱,所以没有检测到新的产物生成。这说明后续工作仍需对酵母表达体系做进一步的优化。以上研究,通过系统整理和分析已知功能的萜烯合酶序列与功能的关系,探索了结合合成生物学技术来系统鉴定植物三萜和倍半萜骨架化合物的方法,有助于植物中三萜和倍半萜骨架化合物的系统挖掘。
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q943;Q811.4
【图文】：

物的合成途径及不同萜烯合酶（引自 Eran Pichersky.2011thetic pathways of terpenoids and different terpene synthases.(Pichersky.2011.The Plant Journal)研究进展Ss）起源于古萜烯合酶，通过系统发育分析通常把30：TPS-a、TPS-b、TPS-c、TPS-d、TPS-e/f、TPS-g 是被子植物特有的分支，TPS-d 是裸子植物特子植物与裸子植物中，TPS-h 目前只在石松属的江发现。其中 TPS-a 主要由倍半萜合酶组成，TPS-bPS-c、TPS-e/f 主要由二萜合成酶组成31。的不同，可将 TPSs 分为两类，主要由三个结构域组利用三核金属簇（trinuclear metal culster）来诱导

三萜合酶和倍半萜合酶元件的挖掘与鉴定丙基阳离子和无机焦磷酸盐，活性位点位于 折叠中间。cla子化异戊二烯底物末端碳-碳双键，第三位产生一个碳离子1，面，如角鲨烯-霍烯合酶32。的预测和实验验证，证实 class I 萜烯合酶有 , β 和 βγ 三杉中鉴定到的二萜合酶 紫杉二烯合酶，它的晶体结构首 βγ 的形式存在， 域有催化活性，βγ 无活性33。然而 class中活性位点位于 βγ 界面， 域无活性34，因此 class II 萜烯合酶的那样，萜烯合酶主要有如下几种不同的构型： , β, βγ 和 在于双功能酶中。

三萜合酶和倍半萜合酶元件的挖掘与鉴定种阳离子中间体在五环三萜的生物合成中发挥作用5物元件主要来源于自然界，据报道有超过 80000 种月，uniprot 数据库中收录的功能鉴定的萜烯合酶仅有合酶但未进行功能鉴定。说明我们目前发现的萜烯合和进行功能表征，为不同功能萜类化合物的发现和

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本文编号：2786068