耐辐射异常球菌类分子伴侣蛋白DohL有序性及抗逆特性研究

发布时间：2020-08-08 23:17

【摘要】：耐辐射异常球菌(Deinococcus radiodurans)对氧化和冷冻等胁迫具有极强的耐受性,大量实验表明,以无规卷曲为二级结构的类分子伴侣蛋白LEA3参与到该菌的抗逆过程。前期研究表明,耐辐射异常球菌的类分子伴侣蛋白DohL属于LEA3蛋白家族,具有LEA3蛋白家族的特征,即含有8个由11个氨基酸组成的保守基序(motifs),但与已报道的以无规卷曲为二级结构的LEA3蛋白完全不同,DohL蛋白能够形成以α-螺旋为主的天然有序的二级结构,该结构的有序性可能与其抗逆功能以及耐辐射异常球菌适应极端环境有关。本研究利用定点突变的方法降低DohL蛋白二级结构的有序性,通过测定圆二色谱,构建重组大肠杆菌菌株以及回补菌株,阐明DohL蛋白有序性与抗逆性的关系。主要研究进展如下:1.生物信息学分析发现,DohL蛋白N端序列(1-103位)为Deinococcus属保守序列,可能是其折叠成有序二级结构的关键区域。分析结果显示,亮氨酸(L)、色氨酸(W)和异亮氨酸(I)位点高度保守,且上述3种氨基酸能够促成蛋白形成有序二级结构。因此,本研究将61位的W和75位的I突变为脯氨酸(P),该突变蛋白命名为WIP,将14-17位4个连续L、61位的W和75位的I突变为P,该突变蛋白命名为LWIP。软件预测突变后的2个蛋白有序性均降低,与DohL蛋白相比,有序性从高到低依次为DohLWIPLWIP。进一步利用圆二色谱技术测定DohL及突变蛋白二级结构的有序性,结果显示,3个蛋白的有序性分别为DohL:82.5%;WIP:62.2%;LWIP:51.4%,有序性与预测结果一致。2.构建重组大肠杆菌进行蛋白异源表达和表型分析,在氧化和冷冻胁迫条件下,表达突变蛋白的重组菌株比表达DohL蛋白的重组菌生存能力减弱。为进一步研究蛋白保护能力的变化,体外分别表达并纯化了DohL、WIP和LWIP 3个蛋白,同时测定DohL及2个突变蛋白在反复冻融和H_2O_2冲击条件下对LDH(乳酸脱氢酶)的保护作用。体外酶活实验表明,以上3种蛋白在胁迫条件下均能保护LDH的活性,具有类分子伴侣功能,保护作用强弱程度为DohLWIPLWIP,表明DohL蛋白保护作用随有序性降低而减弱。3.为验证DohL及2个突变蛋白的抗逆功能,构建了3个回补菌株Com-dohl、Com-wip、Com-lwip,并进行高浓度H_2O_2胁迫处理。实验结果显示,3个回补株均能够不同程度回补突变株耐受氧化胁迫的能力,且3个回补株的回补能力强弱为Com-dohlCom-wipCom-lwip,说明DohL蛋白的抗逆功能随有序性降低而减弱,进而导致菌株氧化胁迫抗性减弱。进一步测定菌株体内总抗氧化能力,测定在80 mM H_2O_2处理条件下野生型、突变株及回补株体内总抗氧化能力。结果表明,Com-wip和Com-lwip回补株相比Com-dohl回补株总抗氧化能力减弱,说明DohL蛋白有序性降低影响其抗逆功能,进而降低菌株氧化胁迫抗性,由此推测,高度保守位点上的氨基酸对DohL蛋白的抗逆功能具有重要作用。综上所述,耐辐射异常球菌DohL蛋白N端区域是该蛋白有序折叠的关键区域,DohL蛋白的抗逆功能随蛋白的有序性降低而减弱。研究结果说明耐辐射异常球菌中氨基酸的组成和比例有利于DohL蛋白结构的正确折叠和抗逆功能的发挥,可能是菌株适应极端环境的结果。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q936
【图文】：

图 1.1AcLEA 蛋白在不同浓度 TFE 的条件下 CD 光谱ectra of AcLEA at different concentrations of trifluoroethanol (TF算数据得出，随 TFE 浓度增加至 66 %时，螺旋结构例相对减少（图 1.2）。但进一步实验表明，AcLEA变，只有在诱导剂 TFE 条件下才会形成以 α-螺旋为

图 1.1AcLEA 蛋白在不同浓度 TFE 的条件下 CD 光谱值 spectra of AcLEA at different concentrations of trifluoroethanol (TFE) （计算数据得出，随 TFE 浓度增加至 66 %时，螺旋结构增加比例相对减少（图 1.2）。但进一步实验表明，AcLEA 蛋白改变，只有在诱导剂 TFE 条件下才会形成以 α-螺旋为主的

在非生物胁迫条件下会产生各种应激机制，以应对不同程度的压力挑战（S这一过程中，产生了各类蛋白以应对非生物胁迫，其中 LEA3 蛋白已成为近几自 Amaranthuscruentus（籽粒苋）的 LEA3 蛋白家族的 AcLEA 基因转化大肠杆迫（40℃处理 2 h）、盐胁迫（0.4, 0.6 和 0.8 M NaCl）以及氧化胁迫（0.1, 0.理下研究该蛋白的作用，结果显示，表达 AcLEA 蛋白的菌株相比对照菌株有aucedo et al. 2017）。杆菌是原核生物的模式菌，而酵母是真核生物的模式菌，同样地，为了研究在细胞中积累的 LEA 蛋白的功能，很多研究者使用酿酒酵母异源表达系统进行析，以此来研究 LEA3 蛋白的功能，同时将空载、来自大麦的 HVA1（LEA3） le4（LEA2）以及 le25（LEA1）转入酿酒酵母，构建重组菌株，在高盐（A.1MKCl）和高渗（C.2M 山梨糖醇）处理条件下，表达 HVA1 基因的重组菌株相后期缩短，由对照菌株的 40h 缩短为 20h，值得注意的是，表达 HVA1 基因的比表达 le25 的菌株短，表明 HVA1 蛋白的产生在高浓度 NaCl 胁迫下比 LE25母细胞，且随时间延长，其生长率更高（Zhang et al. 2000）。

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本文编号：2786247