RNA原位检测技术的开发及其在lncRNA检测中的应用

发布时间：2020-08-09 09:39

【摘要】：RNA表达具有高度异质性,准确检测RNA的表达丰度和空间位置能够了解不同时期细胞和组织中各基因动态表达情况,并可以更好地理解机体成分间的作用机制。本研究旨在开发一种利用双连接探针对目标基因的表达进行定量定位分析的新型单分子RNA原位检测技术,并更高效地应用构建空间基因表达谱。在锁式探针和滚环扩增的基础上,本研究主要创新在于设计新型探针-双连接探针,通过考察验证双连接探针的设计原则,测试比较检测效率,并将其应用到不同种类RNA的检测,建立了利用双连接探针基于滚环扩增的RNA原位检测的方法。首先以ACTB管家基因为模型,类比锁式探针检测反应,通过优化逆转录、双连接探针第一步连接和基于夹板的成环反应体系,建立基于双连接探针的RNA原位检测基本方法。比较双连接探针与锁式探针的方法,得出双连接探针检测效率高于锁式探针。然后将此方法扩展到其他mRNA的检测,以在细胞爬片和病理组织切片中检测KRAS和乳腺癌相关基因为例,考察方法的特异性和稳健性。而后将方法应用到癌细胞lncRNA的多重检测和mRNA与lncRNA的同时检测,再次证明方法的稳健性。检测lncRNA SNP位点时,通过改变探针设计、清洗条件、连接酶和反应体系,可使假阳性率降低到1%以下。本文通过双连接探针与锁式探针多次比较实验,验证本方法更加高效。同时又通过SNP位点的检测实验,实现了较高的单碱基识别特异性。此方法可以结合多种原位测序技术,实现在单细胞、单分子、单碱基水平上的RNA高度多重基因表达原位检测。由于原位检测结果与临床信息的一致性,本方法优化后有望成为应用于基础研究和临床诊断的新技术。
【学位授予单位】：华侨大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q522
【图文】：

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接着在靶序列上重复这种探针对单元，只是每组间的荧光团颜色不同，这样既可以增加信号点强度，又可以通过不同颜色的空间位置顺序解码对应序列，进而检测出其对应基因。第二种方法是基于不同颜色光谱的比例，无需知道具体的空间位置排列，通过已知检测探针的荧光基团比例读出相应基因型（图 1.4）。虽然相比单种荧光标记扩大了检测通量，但是此种方法仍然难以扩展到 30 个基因以上。

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图 1.3 基于空间位置编码 smFISH 原理图 1.4 基于光子比例编码 smFISH 原理为了克服扩展性问题，LongCai[15]又开发出了基于时间条形码技术的顺序荧光原位杂交技术（sequentialfluorescenceinsituhybridization，seqFISH），通过对同一 mRNA 分子进行连续多轮相同碱基序列的探针杂交，通过每轮标记不同颜色的荧光团，以时间序列颜色顺序进行基因编码（图 1.5）。此方法可以通过增加与有限的荧光团杂交的轮数来扩展多重检测能力。

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