新型无标记分析技术及微流控纸芯片设计制备研究

发布时间：2020-08-09 19:12

【摘要】：无标记生物分析技术是近年来新兴发展的一类分析新技术,其无需繁琐复杂的标记过程,能够实现对生物样品的直接测定,具有流程短、速度快、成本低和操作简单等优势,已成为分析领域一个新的发展趋势。微流控纸芯片是近几年发展起来的一种基于纸的微流控分析技术平台。微流控纸芯片集成了进样、反应、检测等一系列操作,具有成本低廉、便携、操作简便、试剂消耗少、分析速度快、生物相容性好、可多元检测等优点。微流控纸芯片作为一种微全分析系统,为无标记生物分析技术提供了有效的检测平台。本论文围绕开发新型无标记生物分析技术和构建基于微流控纸芯片的无标记多元分析检测体系,开展以下研究:开发了一种新颖、简单、快速、灵敏、低成本的无标记比色分析方法,实现对还原型谷胱甘肽(GSH)相对于其类似物半胱氨酸(Cys)和同型半胱氨酸(Hcy)的高选择性测定。本实验中,邻苯二胺(OPD)可被银离子(Ag~+)氧化,生成银纳米颗粒(AgNPs)和淡黄色2,3-二氨基吩嗪(简称OPDox),OPDox的紫外吸收峰中心为429 nm。生成的AgNPs能进一步催化OPD与Ag~+之间的氧化还原反应。在GSH存在下,GSH可与Ag~+发生螯合作用,从而抑制了Ag~+的氧化能力。GSH还可与AgNPs发生相互作用,抑制AgNPs对上述显色反应的催化能力。此外,GSH还能将氧化型有色产物OPDox还原,最终导致检测体系褪色,紫外吸收强度降低,从而实现GSH的无标记、选择性测定。所提出的基于Ag~+-OPD显色反应的传感体系,可实现GSH从2 nM到1μM宽线性范围的检测,检测限低至1.7 nM。该方法还被成功应用于血浆和尿液中谷胱甘肽的检测,检测结果理想。设计了一种具有化学发光时间分辨检测性能的双层三维微流控纸芯片。该微流控纸芯片以层析滤纸作为亲水基底,石蜡为疏水涂层,使用丝网印刷技术制备出亲疏水三维微流控通道。所制备的三维微流控纸芯片结构紧凑,具有一个进样区和多个检测区。使用鲁米诺-H_2O_2化学发光体系进行测试,其在化学发光动力学曲线上得到了四个分离良好的化学发光峰,其分离度高达20左右,具有优异的化学发光时间分辨检测性能。所制备的化学发光时间分辨检测型微流控纸芯片,为实现多物质同时检测提供了良好的检测平台。基于设计制备的化学发光时间分辨型三维微流控纸芯片,构建了一种无标记化学发光多物质同时检测体系,成功实现了对葡萄糖、乳酸、胆固醇和胆碱的同时测定。该检测体系,首先通过壳聚糖将化学发光催化剂钴离子和不同氧化酶固载修饰于四个检测区,加入目标分析物后,目标分析物在其特异性氧化酶的催化下,自发发生氧化反应,从而在各检测区定量生成H_2O_2。将鲁米诺溶液从三维微流控纸芯片的进样区加入微流控纸芯片后,鲁米诺溶液依次迁移至四个检测区,在钴离子催化下,与检测区的H_2O_2发生氧化反应,发生时间分辨型化学发光信号。基于化学发光动力学曲线中产生的四个化学发光峰的强度,分别实现对葡萄糖、乳酸、胆固醇和胆碱的定量检测。所构建的无标记分析方法可实现葡萄糖、乳酸、胆固醇和胆碱的同时测定,其检测范围如下:葡萄糖(0.01-1.0 mM/L)、乳酸(0.02-5.0 mM/L)、胆固醇(0.01-0.4 mM/L)和胆碱(0.001-1.0 mM/L),检测限分别为8μmol/L、15μmol/L、6μmol/L和0.07μmol/L。所制备的多物质同时检测型微流控纸芯片,在生命分析、临床领域具有巨大的应用潜力。
【学位授予单位】：合肥工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q503;O657.3
【图文】：

质量型,无标记,检测平台,目标分析

过程通常是标记分析技术中最为耗时耗力和高成本的环节，而无标记好省去了这一步骤，能够容易地实现快捷、简单、低成本的生物分析，实时监测和高通量检测成为可能。无标记生物分析技术主要类型1.2.2.1 质量型无标记生物分析技术质量型无标记生物分析技术原理是将目标分析物固有的物理、化学、生种质量变化关联起来，用质量变化程度反应目标分析物的浓度、活性等常用的质量型无标记生物分析技术平台是石英晶体微天平[12, 13]，该仪器可以捕捉到气相或液相中极微弱的质量变化。利用这一功能，可以在天平微传感器的基底芯片上修饰目标分析物的识别材料，构建针对目特异性检测界面，当气相或液相中的目标分析物接近检测界面时将被异性捕捉，引发质量变化信号，实现实时的生物分析检测。根据这种分析等[12]使用石英晶体微天平构建了一种可特异性识别 IgE 的质量型无标（如图 1.1），实现了对 IgE 的快捷、简单、灵敏的检测，检出限为 0.5nm

无标记,TaqDNA聚合酶,生物传感器,力学

物和应力变化信号的介质，它是一种微小应力变化的梁臂的力学型无标记生物分析技术的检测过程实际是下的产生、传导和量化过程：首先在悬梁臂上固载目标得检测界面，然后将此装置至于待检体系中，该装置对物质无动于衷，一旦识别材料附近出现足够多数量的目之间发生相对强的识别作用，对检测界面产生一个相对曲，通过这种微小的形变就可以将产生的应力信号传导析物的分析检测。根据这种检测原理，Savran 等[14]开发测的力学型无标记生物分析技术，该技术基于 Taq DN适配体的特异性识别作用，当这种识别作用达到一定曲的应力，再利用干涉法感知和放大悬梁臂的形变程获得了 Taq DNA 聚合酶浓度与应力变化信号之间的量A 聚合酶 pM 级的测定。根据报道，这是第一起运用力生物分析的案例。

尿酸,比色分析,无标记,葡萄糖

第一章绪论可以容易的进行定性分析。例如怀孕试纸对女性妊娠的检测是通过是否在试纸上观察到色带来定性判断受检尿液中人绒毛膜促性腺激素（HCG）浓度是否达孕期水平，从而实现怀孕检测。另外，在比色法中可以通过检测体系吸光度、计算机程序提取体系照片的颜色信息等方法将信号变化量化，实现目标分析物的定量检测。Wang 等[3]开发了一种用于尿酸和葡萄糖检测的无标记比色分析技术（如图 1.4），原理是先在层析纸上固载显色剂和特定的氧化酶以及显色反应催化剂，构建纸基比色传感平台。尿酸或葡萄糖可以和对应的氧化酶反应，生成过氧化氢，在显色反应催化剂的催化作用下过氧化氢可以使显色剂发生显色反应。然后使用智能手机相机拍照记录彩色图像，通过计算机程序读取彩色照片的灰度值用于定量分析。该方法对尿酸和葡萄糖的检测限分别达到 0.003 mM 和 0.014 mM。

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