基于荧光假单胞菌群体感应的抑制剂筛选及抑制机理探究

发布时间：2020-08-17 17:18

【摘要】：荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)是多种冷藏水产品的特定腐败菌(Specific Spoilage Organism,SSO),它能够在低温环境下生长繁殖并产生极耐热的蛋白酶和脂肪酶,引起食品腐败变质。P.fluorescens还能产成大量的生物被膜,帮助细菌躲避不利因素的危害并使细菌形成耐药性。生物被膜一旦形成,则很难彻底去除,给食品安全造成巨大威胁。在食品加工过程中进行普通的消毒对除去生物被膜是无济于事的,由于细菌会对杀菌剂的抵抗力不断增强,因此需要发展新的方法来控制细菌产生的生物被膜以及对食品的致腐能力。研究表明,荧光假单胞菌的多种与食品腐败相关的特性都受到其群体感应(Quorum Sensing,QS)系统的调控。因此,寻找群体感应抑制剂(Quorum Sensing Inhibitor,QSI)来干扰QS所参与或调控的生理活动,可能为消除细菌的耐药性、延长食品的货架期提供可能的途径。但是,传统方法来寻找QSI往往是随机的,效率低、成本高,且需要大量的实验,而计算机辅助筛选QSI则恰好可以解决这一问题。鉴于此,本研究以荧光假单胞菌为研究对象,以其QS系统为靶点,通过同源建模、虚拟筛选、分子对接等方法,更加直观、便捷地寻找新的QSI,并对其抑制机理进行探究,最后,将筛选到的QSI与静电纺丝技术结合,将其应用到水产品保鲜中,为探究荧光假单胞菌的QS系统调控的致腐机理以及寻找新的延长水产品货架期、增强水产品安全性的方法提供参考。主要结果如下:(1)通过对荧光假单胞菌进行全基因组测序及基因注释,得到了其QS系统的LuxI型和LuxR型蛋白的氨基酸序列。通过同源建模方法得到了受体蛋白的三维结构。用SAVES、QMEAN等方法对所建的蛋白模型的质量进行评价,发现所建的蛋白模型具有较好的质量。(2)以LuxI型和LuxR型蛋白为对接靶点,从传统中药化合物数据库(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)中筛选潜在的QSI。结果发现,有10种物质具有群体感应抑制活性(命中率66.67%)。苯甲醇、甲酸玫瑰酯、玫瑰醇和鱼腥草素等物质具有很强的QS抑制活性。活性最强的苯甲醇对P.fluorescens P07的群体感应表型具有显著的抑制效果。分子对接技术分析其对QS系统的抑制机理,发现苯甲醇的抑制机理可能是由于其紧密地结合到LuxI型蛋白中,从而阻断了P.fluorescens P07信号分子的产生并阻断了其QS通路,从而达到抑制的效果。(3)为了筛选更加安全高效的QSI,我们以LuxI型和LuxR型蛋白为对接靶点,从食物组分数据库中筛选潜在的QSI。结果发现,有19种物质具有QS抑制活性(命中率76.00%)。其中,(+)-儿茶素、(-)-表儿茶素、没食子酸丙酯、橙皮苷、番茄红素以及茄尼醇等物质具有很强的QS抑制活性。具有最强QS抑制活性的(+)-儿茶素对P.fluorescens P07的胞外蛋白酶产生、泳动性、生物被膜以及EPS的形成具有显著的抑制效果。(4)分别用基于分子相似性、基于配体和受体药效团模型的方法,从ChEBI、ChEMBL、中药数据库(TCM Database@Taiwan)和ZINC天然产物数据库中筛选P.fluorescens P07的QSI。结果发现了丙酸-2-苯乙酯、和厚朴酚、厚朴酚、尼泊金乙酯、姜酮、愈创木酚、辛可尼丁、水杨苷、柠檬醛、香兰素、褪黑素、10-十一烯酸以及(L)-(+)-酒石酸二乙酯等具有较强的QS抑制活性的物质。(5)用具有较强QS抑制活性的香兰素处理P.fluorescens P07并检测其对细菌的群集性、生物被膜以及EPS的影响,并利用转录组学探究其抑制机理。结果发现,香兰素对于P.fluorescens P07的群集性、生物被膜以及EPS均具有显著的抑制效果。转录组学测试发现经香兰素处理后,细菌的差异表达基因上调的有92个,下调的有87个。细菌生物被膜的减少是香兰素对细菌的运动性、粘附性、趋化性、EPS的含量以及QS系统等多种因素影响所致。(6)通过将静电纺丝技术与筛选到的QSI相结合,制备了PLA 没食子酸丙酯以及PCL 表儿茶素同轴静电纺丝纤维,对制备的纳米纤维进行表征并测试其对冷藏条件下三文鱼片中P.fluorescens P07的致腐性的抑制效果。结果发现,制备的静电纺丝纤维直径较小,表面光滑,无串珠及其他缺陷,并具有核-壳结构。通过对纺丝纤维的性能进行表征,发现其热稳定性、拉伸强度等性能均能满足冷藏条件需要,且纤维能很好地包裹QSI并具有缓释行为。载有QSI的纺丝纤维在没有抑制三文鱼片中细菌的生长的前提下,对鱼片中挥发性盐基氮(Total Volatile Basic Nitrogen,TVB-N)、三甲胺(Trimethylamine,TMA)以及细菌水溶性胞外多糖的生成能力都显示了显著的抑制效果,并显著延缓了三文鱼片中Ca~(2+)-ATPase活性的降低速度和三文鱼片肌肉组织的劣变速度。载有QSI的纺丝纤维对细菌的致腐能力也有显著的抑制作用。
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS201.3
【图文】：

图 1-1 革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的 QS 信号分子基高丝氨酸内酯，AHL；2：N-3-羟基酰基-高丝氨酸内酯（3-hydroxy-丝氨酸内酯（3-oxo-AHL）；4：呋喃糖基硼酸二酯，AI-2；5：PQS；6：8：金黄色葡萄球菌自诱导肽，AIP-1.Fig.1-1 QS signal molecules of Gram-negative and Gram-positive bacteri1: N-acyl homoserine lactone (AHL); 2: N-(3-hydroxyacyl) homoserine lacl)-l-homoserine lactone; 4: Furanosyl borate ester form (AI-2); 5: Pseudom; 6: Diffusible signalling factor (DSF); 7: Hydroxyl-palmitic acid methyl esAutoinducing peptide (AIP-1) of Staphylococcus aureus. QS 系统氨酸内酯是很多革兰氏阴性细菌QS系统的信号分子[10]。AH也被称为 LuxI/R 型 QS 系统，是人们最早发现也是研究最为。目前已经在近 100 种革兰氏阴性细菌中发现存在此系统[11- luxI/R 调控基因组成。其中，luxI 为信号分子合成酶表达基表达基因。在 AI-1 型 QS 系统中，信号分子的合成途径为：及 AinS 等蛋白酶的催化作用下，酰基化的酰基载体蛋白和

靶基因转录的目的，其作用机制如图 1-2 所示。然菌的 QS 系统没有 luxI 基因及其指导合成的 LuxI含有 LuxR 蛋白类似物（SdiA），能感知其他菌群明 AHL 不仅与细菌种内的信息交流有关，而且与

QS 系统分子还有其他种类，如在肠出血性大肠杆菌中还发现能调控 AI-3 型信号分子[19]。AI-3 型 QS 系统较前两种系统调控过性菌的 QS 系统类分子（autoinducter peptide, AIP）作为 G+菌的 QS 系统的信号传递，因此，AIP 介导的 QS 系统是革兰氏阳性细菌交的 AIP，通常由氨基酸残基数为 5~10 个的环状寡肽经修饰肽类分子大小各异，且其不能自由透过细菌的细胞壁，因此转运系统（ATP-binding-cassette）的协助将 AIP 转运到细胞图 1-4 所示。AIP 信号分子与 AHLs 相似，随细菌浓度的增当其在环境中积累达到阈值时，寡肽类信号分子与膜上的信位于细胞膜上的组胺酸蛋白激酶，进而激酶中组氨酸残基磷酶与胞内应答调节子的天冬氨酸残基结合，使之磷酸化并被节子通过调控 AIP 基因、受体激酶、应答调节子基因以及从而起到调控的功能[21]。

本文编号：2795607