基于原子力显微镜技术的毒素蛋白检测与动态成像研究

发布时间：2020-08-17 17:49

【摘要】：背景:生命科学的进步与发展离不开成像仪器的开发与成像技术的突破。如何通过成像技术来检测、分析生物大分子的各种变化,从中提取分子信息,定性、定量这些生物大分子等都具有重要的科学意义和应用价值。AFM以微悬臂作为力学信号媒介可直观展现生物大分子的超精细结构和各种物化性质,大大提高了我们对蛋白质结构和其在生化反应中所扮演角色的理解,为解决生物大分子功能和分子层面生理行为的生化问题提供了新的技术手段。目的:本研究旨在运用多模态AFM建立生物大分子检测与生物大分子互作研究平台的新方法。一是开发针对超痕量生物毒素的无标记甄别方法;二是建立在近生理条件下原位动态研究毒素生物学效应的新平台;三是与DNA折纸技术结合,通过设计毒素-DNA标签嵌合分子,对室温条件下的嵌合分子可控自组装行为进行前期先导研究,为进一步探索毒素受体与作用机制奠定基础。方法:1.在超痕量生物毒素无标记检测部分,选用ABR,RT,ETX,BoNT/A和SEB这5种生物毒素做为模型,分别进行提取纯化,并通过APTES修饰的云母进行表面固定,经过实验条件的优化使毒素蛋白在云母表面以单分子颗粒的形态沉积。首先采用AFM和PiFM对毒素单分子颗粒进行形貌与PiF反馈的成像,并以此对基底、缓冲液中盐成分和蛋白进行定性。其次收集各毒素蛋白颗粒的PiF谱,参考傅里叶变换红外吸收谱中酰胺带的吸收峰,筛选出10个与蛋白二级结构相关的特征PiF吸收带,并对这些信号带的峰位与强度做PCA分析。通过PCA的结果聚类每种毒素蛋白,构建针对每种毒素蛋白的单分子PiF谱数据库。最后混合三种毒素蛋白制作模拟样品,并对模拟样品进行PiFM表征,在一定区域收集模拟样品的PiF谱,将PiF谱导入先前构建好的毒素PCA模型,最终鉴定其所包含的毒素蛋白成分。2.在生物毒素原位动态成像研究部分,针对能够使人血红细胞具有成孔效应的ETX蛋白为研究模型,通过低渗缓冲液滋洗的方式制备单层人血红细胞外膜与内膜,运用环境可控的AFM平台在近生理条件下原位动态的观察ETX与内外膜的相互作用,表征毒素在不同温度,不同膜区域内成孔的特性,运用AFM探针分别表征完整红细胞膜与成孔红细胞膜的力学差异。结合重组红色荧光mScar ETX,通过共聚焦分析ETX受体在红细胞膜表面的分布。3.在生物毒素可控自组装研究部分,采用重组表达的方法设计N末端含有一个Cystein残基linker的c-linker-ETX蛋白,构建相应的原核表达载体行蛋白可溶性表达,纯化该重组c-linker-ETX,与末端修饰马来酰亚胺的寡核苷酸序列形成1对1的蛋白-核酸嵌合体蛋白,命名为DNA-c-linker-ETX,通过溶血实验与CD实验对比DNA-c-linker-ETX与rETX之间有无溶血和二级结构的差异。通过AFM原位观察4种不同结构的矩形DNA折纸(DNA origami)在室温下自组装的动力学特征,探讨origami缺损面积与结构特点对其室温下的合成与效率的影响。为研究ETX蛋白的可控组装奠定基础。结果:1.建立了超痕量生物毒素无标记检测方法。经过表面修饰与蛋白浓度优化,成功地在云母载片上制备了单分子毒素颗粒的样品,AFM表征与粒径分析均与参考蛋白结构和分子量所做的预期相一致。其中用BoNT/A代表大分子蛋白,ABR与RT代表中等大小分子蛋白,ETX与SEB代表小分子蛋白。气相条件下BoNT/A粒径在10 nm左右,ABR与RT在5 nm左右,ETX与SEB在2.5 nm左右。随后对每种毒素样品进行单波长PiFM表征,通过云母基底PiF信号的反转对基底上的蛋白颗粒分布进行了定性区分。对成像区域内的蛋白颗粒光诱导力谱的收集和PCA分析,将5种毒素蛋白进行了很好的聚类,以其中ABR、RT、ETX为例制备混合模拟样品,经收集PiF谱和PC分析,检测模拟样品中三种毒素蛋白ABR:RT:ETX的信号比分别为9:35:55,该检测值位于真实值(11:38:131)与理论值(2:3:5)之间。与傅里叶变换红外谱相比,光诱导力谱在酰胺信号带的分辨率更高且能直接显示代表蛋白二级结构归属的信号带。通过对每种毒素的PiFM成像比较发现,ETX与SEB的光诱导信号反馈远小于ABR,RT和BoNT/A,显示该检测体系对于分子量小于30 kDa的蛋白样品检测的不足。但可以将云母基底替换成增强Au基底加以改善。2.完成了对成孔蛋白ETX成孔效应的原位动态成像研究。Western blot实验与扫描电镜提示天然状态下ETX形成七聚体复合物与人红细胞膜相互作用,在红细胞膜表面成孔并破坏膜的完整性。高分辨AFM在近生理条件下原位观察了人红细胞膜孵育ETX后的形态变化,发现ETX只对人红细胞外膜具有成孔效应,其中通过环境可控AFM的动态成像发现当温度高于23℃时6μg/mL的rETX才使红细胞膜外成孔,而随着温度下降到23℃以内,成孔效应将停止。此外还观察到,ETX作用下,膜的完整性随时间而降低。通过制备“水泡”样结构的红细胞膜模型,显示ETX对于死细胞膜也具有成孔效应。3.对基于DNA折纸术的生物毒素单体可控自组装体系进行了前期研究。我们成功构建了位点特异性的DNA-c-linker-ETX嵌合蛋白,发现该嵌合策略不会对ETX的溶血活性及二级结构产生影响;对室温下自组装的DNA纳米结构的动力学特征研究发现,“接缝”结构能引导短链完成预退火形成的缺损DNA origami的生长。其正确折叠的效率与缺损的面积和预组装的结构相关。在“接缝”结构存在的条件下,1/4缺损的矩形origami能够在室温下获得90%的修复率。结论:本研究围绕多模态AFM在生物大分子检测、生物效应和纳米结构组装方面做出新的探索。首先,通过PiFM与PCA组合的策略,建立了蛋白毒素单分子无标记痕量检测方法,实现了对ABR,RT,ETX三种混合模拟毒素的甄别,并构建了ABR,BoNT/A,RT,ETX,SEB五种分子量不同、分子大小有别的生物毒素单分子PiF谱数据库;其次,应用高分辨AFM在近生理环境下对ETX蛋白与人血红细胞的成孔效应进行了原位、动态的表征。AFM结果显示在这个过程中ETX对红细胞内膜不产生成孔效应,且在无ATP活动的单层人血红细胞膜上同样能够完成与膜的特异性结合。AFM对成孔红细胞膜的高分辨成像未给出ETX七聚体复合物是构成红细胞膜表面孔洞的直接证据。最后,基于DNA折纸术设计并成功构建了DNA-c-linker-ETX嵌合蛋白,为下一步定量,可控的研究ETX七聚体在成孔过程中的角色提供了有力的工具,也为下一步研究生物大分子在生理条件下与origami的定向排列与功能验证提供理论基础。
【学位授予单位】：军事科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q-336
【图文】：

示意图,示意图,探针,针尖

图 1AFM 工作示意图a）典型的力-距离曲线示意图，反映了探针与样品表面的相互作用力，通过施加于针尖的 F 可以计算出样品的弹性模量 E；b）AFM 工作状态下探针针尖的力曲线示意图；c）轻敲模式下 AFM 探针扫描样品表面，实时获得力反馈。基于不同的应用需要，AFM 发展出静态的成像模式（也称为接触）模式和各种动态（非接触或轻敲）模式：1，轻敲模式 AFM，通过使用处于振动状态的探针针尖对样品表面进行敲击来生成形貌图像。扫描过程中，探针悬臂的振幅随样品表面形貌的起伏而变化，从而反映出形貌的起伏。其优点是消除了会对样品造成损伤并降低图像分辨率的横向力影响，并且可以不受成像环境下样品表面附着的水膜的影响。缺点是扫描速度比接触模式稍慢一些。2，接触模式 AFM，探针针尖始终与样品表面保持接触。当扫描管引导针尖在样品上方扫过（或样品在针尖下方移动）时，悬臂梁受力发生弯曲，从而反映出形貌的起伏。其优点是可以达到很高的分辨率，缺点是有可能对样品表面造成损坏，横向的剪切力和表面

成孔,磷脂,成像,毒素

和产气荚膜溶血素(Perfringolysin O)研究较为深入。Shao 等通过 AFM 对霍乱毒素和产气荚膜溶血素在磷脂层上自组装成像使我们可以直观的看到霍乱毒素 5 个 β亚基聚体中间约2 nm的孔洞（图2 a）；PFO的成像对胆固醇依赖性溶细胞素（CDCs）的成孔前体的跨膜机制带来直接证据[18,19]（图 2 b）。图 2 成孔毒素在磷脂层成孔的 AFM 成像a）磷脂双分子层上的霍乱毒素 B 亚单位五聚体 AFM 成像[18]；b）磷脂双分子层上的产气荚膜溶素（PFO）孔复合物 AFM 成像[19]PFO 作为 CDCs 成孔的模型的代表，其成孔机制已研究的较为清楚，Feil 等

晶体结构,单体

图 3 PFO 与 ETX 单体晶体结构PFO 具有四个结构域 D1，D2，D3，D4；ETX 具有 3 个结构域 D1，D2，D3如图 4 所示，近年来利用 DNA 分子组装纳米形状和图案被用来制造纳米工具被越来越多的应用在生命科学领域[28-30]。模块化的 DNA 单元通过与功能化的蛋白质嵌合，可以在相对独立的体系内定性定量的展示单分子蛋白的生化信息，比如转录因子与 DNA 的结合[31]，酶对核酸的剪接[32]和单体蛋白的功能性聚合[33]在这些例子当中DNA链为蛋白质提供了机械刚性和相对较高的物理化学稳定性此外通过引入各种酶切位点，利用一系列高度特异性的 DNA 酶，就能够间接地的处理和操纵嵌合分子，并通过 AFM 予以表征。

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