桔青霉来源的核酸酶P1在黑曲霉系统中的重组表达研究

发布时间：2020-08-18 08:37

【摘要】：来源于桔青霉的核酸酶P1隶属于核酸酶S1/P1家族,其家族成员中的核酸酶P1和核酸酶S1均是单链特异性核酸酶,能够催化单链DNA或RNA生成核苷酸,生成的5’-核苷酸及其衍生物广泛应用于制药、食品和核酸结构的研究中。在生物制药方面,其可用于制造各种生化药物。在食品保健方面,在酵母自溶过程中添加核酸酶P1促进RNA转变为5’-GMP及5’-AMP的速率,这两种物质是制作各种食品调味剂的原料。在核酸研究方面,核酸酶P1的主要功能有促进核酸结构的研究和碱基组成的分析。目前国内核酸酶P1供不应求,核酸酶P1的生产菌主要为桔青霉,而桔青霉生产的核酸酶P1具有纯度不高,杂蛋白过多且有毒素掺杂影响后续的分离纯化等问题。核酸酶P1异源表达的宿主有大肠杆菌和酵母细胞,表达的核酸酶P1活力较低。而本研究在黑曲霉中实现了核酸酶P1的高效重组表达,并将其应用于核苷酸的生产中。本文以一株低蛋白背景的无孢黑曲霉Bdel4(LB3ang02D4,在黑曲霉SH-2菌株基础上敲除了糖化酶glaA、淀粉酶aamA、An05g02100和An12g06930)为宿主菌,构建了不同表达策略的核酸酶P1的黑曲霉表达质粒,转化黑曲霉筛选出了一株核酸酶P1表达最优的转化子,发酵酶液经His亲和层析纯化后,进行了核酸酶P1酶学性质的研究,并探索了其在核苷酸的生产中的应用。主要研究的内容如下:(1)根据Uniprot公布的NP1的蛋白序列,经过密码子优化后人工合成Nuc P1基因。将6xHis标签加在Nuc P1基因的C末端,以用于后续的His亲和层析获得核酸酶P1的纯酶液。构建采用Kexlinker(糖化酶自带的信号肽切割位点)、2A肽、融合蛋白等不同表达策略的核酸酶P1的表达框,基于同源重组原理定点整合核酸酶P1的表达框到黑曲霉基因组糖化酶glaA基因位置、18S rDNA和28S rDNA的多拷贝位置,通过测定转化株的酶活水平筛选出酶活最高的一株黑曲霉转化株Bpnu-18S-2,其发酵至144 h时酶活达到89.2 U/mL。(2)通过His亲和层析纯化重组核酸酶P1菌株产生的发酵液,纯化后核酸酶P1的分子量大小为38kDa,之后用糖苷酶PNGase F去糖基化后得到核酸酶P1大小为30 kDa,与PDB数据库预测的核酸酶P1分子量一致。基于纯化所得的核酸酶P1研究其酶学性质,测定得到重组核酸酶P1反应最适pH为5.3,最适温度为65°C,加入2 mmol/L的Cu~(2+)、Mg~(2+)、Zn~(2+)能够提高核酸酶P1的酶活,同时也显著提高了核酸酶P1的耐热性,Ni~+约降低20%酶活力,但却能提高核酸酶P1的耐热性,K~+、EDTA使核酸酶P1的酶活力约降低40%。将黑曲霉转化株Bpnu-18S-2的发酵上清液加入酵母自溶体系中以提高核苷酸的产量,添加75 U的核酸酶P1可生产出14.13 mg/mL的核苷酸,比不添加核酸酶P1时产生的单位核苷酸的产量提高了4.51 mg/mL。
【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q78
【图文】：

核苷酸

生命最基本的物质之一，是一种由许多核苷酸组成的生物大分子化组成成分不同可分为脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）。，传递遗传信息。RNA 是蛋白质合成的过程中的主要原料。其中类，第一是核糖体占比最大的物质—核糖体 RNA（rRNA，占 80%NA（tRNA，占 15%），是蛋白质合成过程的搬运工；第三种是信占 5%），作为模板用于合成蛋白质。[1,2]的水解产物—核苷酸全水解的产物有四种（嘌呤、嘧啶、戊糖、磷酸），其均属于碱性可产生核苷酸。核苷酸的组成方式为核苷分子中戊糖上的醇羟基分子碱基的成分不同分为四类：5’-腺嘌呤核苷酸（AMP），5’-），5’-胞嘧啶核苷酸（CMP），5’-尿嘧啶核苷酸（UMP）[3-5]（

活性中心结构,核酸酶P1,核酸酶

图 1-1 核酸酶 P1 活性中心结构图re1-1 Schematic diagram of the active site of nuclease P性质性质被广泛研究，总结在表 1-1。如前所述，尽相同。核酸酶的分子大小在 13 kDa-46 kDa 酸酶 SNase 是一种依赖于 Ca2+、分泌于胞外的能够耐受一定浓度范围的强酸。来源于米曲霉其功能为水解单链 DNA 和 RNA 并应用于分析的核酸酶 P1 含有 270 个氨基酸，分子量大小为 29.227 kDa。N-糖基化（N-linked glycosylation天冬酰胺-XXX（任一种氨基酸）-丝氨酸/苏氨位和表达以及酶的稳定性与活性均有着显著作

核酸酶P1,糖基化位点,核酸酶,脱氧核糖核酸酶

图 1-2 核酸酶 P1 的糖基化位点分析Fig 1-2 Analysis for N-Glycosylation sites of nuclease P1表 1-1 常用核酸酶理化性质Table 1-1 Properties of some nuclease名称最适温度最适 pH MW（kDa）研究者脱氧核糖核酸酶Ⅰ60℃ 7-8 31 kDa Kunitz[14]， Salniko核酸酶 P1 65-70℃ 5-6 44-46 kDa 盖宏伟[16]，娄永江[1SNase - - 16.8 kDa 徐立东[18],宋吉奎[峰[20]核酸酶 S1 35℃ 4.2 32 kDa Volker M. Vogt[21]

【参考文献】