ScPif1解旋酶的结构与功能研究
发布时间：2020-08-18 15:05
【摘要】：Pif1解旋酶作为一种依赖于ATP供能的DNA解旋酶,广泛分布于原核生物和真核生物体内,在基因组稳定性的维持和核酸代谢调控等方面发挥着重要作用。酿酒酵母Pif1(Saccharomyces cerevisiae Pif1,ScPif1)解旋酶作为Pif1家族中的典型成员,是该家族中被最早鉴定并且深入研究的成员之一。体内研究表明,ScPif1解旋酶参与端粒稳定性的维持、冈崎片段的成熟、DNA复制过程中G4 DNA的解除以及同源重组修复等多种重要代谢途径。体外研究则显示ScPif1同时拥有5'-3'方向的双链DNA、RNA/DNA杂交链以及G4 DNA的解旋活性,其中最为引人注目的是其高效的G4DNA解旋功能,在体内条件下,G4 DNA因其高度的稳定性而成为生物体生理代谢的一大阻碍,ScPif1通过其高效的G4 DNA解旋功能而在多种生理代谢途径中发挥着重要作用。目前,关于ScPif1的研究主要集中在体内或体外的生理生化实验中,对于ScPif1结构的研究则非常有限。本研究针对以上难点,首先采用多序列比对的方式鉴定了ScPif1的解旋核心结构域,并通过二级结构预测的方式,对全长ScPif1蛋白进行了合理的截短设计,通过大肠杆菌表达系统对截短后的ScPif1~(237-780)蛋白进行了表达纯化,获得了可用于结晶实验的高纯度蛋白样品,并在随后的结晶实验中获得了多种DNA复合物的晶体,结合硒代蛋白晶体的反常散射数据获得的相位,首次解析了ScPif1解旋核心结构域的高分辨率三维结构。之后,基于解析的晶体结构,本研究综合利用定点突变实验、凝胶过滤层析技术、X射线小角散射技术、基于荧光各向异性的DNA结合技术、快速停留FRET技术以及单分子实验技术等多种实验方法对ScPif1的解旋核心结构域的功能机制进行了深入地研究,取得了如下主要成果:1)首次在ScPif1的晶体结构中观察到了可以特异结合ATP的保守Q基序,并通过对该基序的突变实验证实了这类基序的缺失会极大地削弱ScPif1对ATP的特异性识别功能。2)首次通过突变体实验揭示了ScPif1特异性结合DNA的分子机制,即His303和His705选择性的识别DNA而不是RNA。这一发现从结构上解释了ScPif1在体内对端粒酶的移除机制。3)通过对ScPif1多种DNA复合物结构的DNA结合位点分析,首次揭示了ScPif1对鸟嘌呤偏好性的结构基础。ScPif1拥有的这类鸟嘌呤碱基偏好性,使其可以更为有效地进行G4 DNA的解旋。4)首次在ScPif1的结构中发现了一段存在于2B结构域外侧并具有独特折叠模式的2C结构域,并证实了该结构域拥有对ScPif1解旋和易位活性的调控作用。5)首次从晶体结构中成功鉴定出了生物学相关的二聚体形式,并在此基础上提出了一种G4 DNA诱导的ScPif1二聚体形成机制。6)首次在晶体结构中发现了一段潜在的G4 DNA结合位点,并通过突变实验验证了该位点中多个氨基酸参与G4 DNA的特异性结合和解旋活性。从结构上解释了ScPif1所具有的G4 DNA识别机制。综上所述,本论文通过对ScPif1解旋核心结构的深入研究,阐明了ScPif1对多种生理底物的识别机制以及结合底物后的寡聚状态,为进一步理解ScPif1在体内发挥的多种功能提供了理论依据。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q75
【图文】：
图 1-1 DNA 的二级结构图示(Saini et al. 2013)Fig.1-1 The secondary structure of DNA随着上世纪 90 年代后期晶体学的进步，第一个源自嗜热脂肪芽孢杆菌的 DNA 解旋酶的晶体结构被解析(Singleton et al. 2007)，随后越来越多的解旋酶结构被确定。这些结构为解旋酶作用机制的研究提供了一个强有利的理论框架，进一步从结构基础上解释了解旋酶的各类活性机制(Singleton et al. 2007)。1.1.1 解旋酶的特性在正常的生理条件下，细胞里的 DNA 双螺旋是处于热力学稳定状态中的，在没有催化剂的情况下，DNA 双螺旋的解旋和退火是由能量和熵控制的。因此，外部能量的输入，即增加熵（如高温等）对于 DNA 双螺旋的解开是必不可少的。由于细胞不能改变其温度或离子环境，往往依赖于解旋酶来克服碱基对熔化时所产生的能量障碍。根据此原理，人们普遍认为解旋酶是通过结合并水解三磷酸核苷酸获得能量来解离核酸结构中的配对碱基。值得注意的是，解旋酶的这类活性与以往定义的单链结合蛋白不同，单链结合蛋白虽然可以瞬间结合并“溶解”较短的 DNA 双链，但这主要是
移动的平均碱基数。这是一个有用且信息含量丰富的参数，因为它不仅反应了解旋酶的物理特性，而且还为人们理解解旋酶相应功能提供了一定的限定条件。使用高精度的单分子实验证明了驱动蛋白马达以分散的 8 纳米步幅沿着微管迁移(Schnitzer et al1997)。解旋酶的解旋过程通常包含有多种行为（例如，NTP 结合和水解，碱基对的熔解和解旋酶移位），这些行为的发生存在先后顺序。对于解旋酶通常采用两种步幅描述其解旋效率（unwinding efficiency）：分为生理学步长（physical step size）和动力学步长（kinetic step size）。生理学步长定义为两次 NTP 分子水解之间解旋酶的质量中心的移动的碱基数。动力学步长则指解旋酶在两个连续的限速步骤之间的平均运动距离。虽然它们在概念上很类似的，但动力学步长大小可以与生理学步长不同(Lucius et al. 2003)。例如，解旋酶 DNA 在消耗 1 个分子的 NTP 后前进了 1bp 的生理学步长，但因为解旋酶内部结构可能需要进行分子间重排导致 DNA 双链此时并未打开，解旋酶会继续消耗 NTP 前移直到 DNA 双链被打开 n 个 bp，此时的 n 值则为动力学步幅。类似现象已由单分子实验证明，如图所示，丙型肝炎病毒（HCV）NS3 RNA解旋酶的动力学步幅为大约 3bp，但实际的物理学步幅则为 1bp(如图 1-2 所示)(Arunajadai et al. 2011)。
西北农林科技大学博士学位论文superfamily，SF1-5），如图 1-3。超家族 1 和 2（SF1 和 SF2）拥有最多数量酶，其成员包括 DNA 解旋酶和绝大部分 RNA 解旋酶。SF3 解旋酶存在于 RNA 病毒中。SF4 和 SF5 是六聚体 DNA 解旋酶，分别起复制和转录终止因子。值得注意的是，随后的研究发现这种分类方式也存在一些不足，最重要的就不能参与核酸双链解链但可以偶联 NTP 水解活性进行核酸链迁移的“马达”蛋gleton 等提议将与各种细胞活动相关的 NTP 酶类蛋白归属为第六个家族（SF6就是 AAA+类(Singleton et al. 2007)。由于本文所研究的 Pif1 蛋白属于 SF1 解旋此这里我们着重介绍 SF1 解旋酶的一般特征。
本文编号：2796372
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q75
【图文】：
图 1-1 DNA 的二级结构图示(Saini et al. 2013)Fig.1-1 The secondary structure of DNA随着上世纪 90 年代后期晶体学的进步，第一个源自嗜热脂肪芽孢杆菌的 DNA 解旋酶的晶体结构被解析(Singleton et al. 2007)，随后越来越多的解旋酶结构被确定。这些结构为解旋酶作用机制的研究提供了一个强有利的理论框架，进一步从结构基础上解释了解旋酶的各类活性机制(Singleton et al. 2007)。1.1.1 解旋酶的特性在正常的生理条件下，细胞里的 DNA 双螺旋是处于热力学稳定状态中的，在没有催化剂的情况下，DNA 双螺旋的解旋和退火是由能量和熵控制的。因此，外部能量的输入，即增加熵（如高温等）对于 DNA 双螺旋的解开是必不可少的。由于细胞不能改变其温度或离子环境，往往依赖于解旋酶来克服碱基对熔化时所产生的能量障碍。根据此原理，人们普遍认为解旋酶是通过结合并水解三磷酸核苷酸获得能量来解离核酸结构中的配对碱基。值得注意的是，解旋酶的这类活性与以往定义的单链结合蛋白不同，单链结合蛋白虽然可以瞬间结合并“溶解”较短的 DNA 双链，但这主要是
移动的平均碱基数。这是一个有用且信息含量丰富的参数，因为它不仅反应了解旋酶的物理特性，而且还为人们理解解旋酶相应功能提供了一定的限定条件。使用高精度的单分子实验证明了驱动蛋白马达以分散的 8 纳米步幅沿着微管迁移(Schnitzer et al1997)。解旋酶的解旋过程通常包含有多种行为（例如，NTP 结合和水解，碱基对的熔解和解旋酶移位），这些行为的发生存在先后顺序。对于解旋酶通常采用两种步幅描述其解旋效率（unwinding efficiency）：分为生理学步长（physical step size）和动力学步长（kinetic step size）。生理学步长定义为两次 NTP 分子水解之间解旋酶的质量中心的移动的碱基数。动力学步长则指解旋酶在两个连续的限速步骤之间的平均运动距离。虽然它们在概念上很类似的，但动力学步长大小可以与生理学步长不同(Lucius et al. 2003)。例如，解旋酶 DNA 在消耗 1 个分子的 NTP 后前进了 1bp 的生理学步长，但因为解旋酶内部结构可能需要进行分子间重排导致 DNA 双链此时并未打开，解旋酶会继续消耗 NTP 前移直到 DNA 双链被打开 n 个 bp，此时的 n 值则为动力学步幅。类似现象已由单分子实验证明，如图所示，丙型肝炎病毒（HCV）NS3 RNA解旋酶的动力学步幅为大约 3bp，但实际的物理学步幅则为 1bp(如图 1-2 所示)(Arunajadai et al. 2011)。
西北农林科技大学博士学位论文superfamily，SF1-5），如图 1-3。超家族 1 和 2（SF1 和 SF2）拥有最多数量酶，其成员包括 DNA 解旋酶和绝大部分 RNA 解旋酶。SF3 解旋酶存在于 RNA 病毒中。SF4 和 SF5 是六聚体 DNA 解旋酶，分别起复制和转录终止因子。值得注意的是，随后的研究发现这种分类方式也存在一些不足，最重要的就不能参与核酸双链解链但可以偶联 NTP 水解活性进行核酸链迁移的“马达”蛋gleton 等提议将与各种细胞活动相关的 NTP 酶类蛋白归属为第六个家族（SF6就是 AAA+类(Singleton et al. 2007)。由于本文所研究的 Pif1 蛋白属于 SF1 解旋此这里我们着重介绍 SF1 解旋酶的一般特征。
本文编号：2796372
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