电化学发光法检测DNA的氧化损伤

发布时间：2020-08-18 12:58

【摘要】：生物体内的氧化应激反应是由于活性氧和抗氧化防御途径不平衡所致。生物体内的DNA、脂类和蛋白质经常暴露在活性氧类物质,如羟基自由基(OH·)、超氧阴离子(O_2~(-·))、单线态氧(~1O_2)和过氧化物(HOO~-)中。这些物质可以氧化DNA造成多种损伤,包括碱基脱落、碱基氧化和单双链断裂等。8-羟基脱氧鸟苷(8-oxodGuo)是羟基自由基和单线态氧存在时最主要的DNA碱基氧化损伤产物。DNA复制时,8-oxodGuo可以引起碱基G:C→T:A的突变,产生基因或遗传毒性。8-oxodGuo作为一种有效的DNA氧化损伤生物标志物在很多领域都有研究和应用。比如在医疗诊断领域中,8-oxodGuo被用于评价个体癌变几率以及诊断与自由基相关的疾病;而在衰老机制或退行性疾病的研究中,8-oxodGuo也是主要的探讨目标。因此,构建可以快速、灵敏检测DNA氧化损伤的分析方法非常有必要。已经报道的检测DNA氧化损伤的方法很多,例如电化学传感(光电化学、电化学、电化学发光)因检测迅速、设备简单、且易于实现高通量等优点引起了很多科学研究者的关注。本论文主要包括两部分内容:第一部分综述了DNA损伤的产生及检测方法,电化学发光法分析的原理、特点及其应用。第二部分为研究内容。首先合成一种“光开关”分子作为电化学发光信号探针,在此基础上引入特异性的DNA糖基化酶放大DNA损伤,构建一种快速简便且高灵敏的电化学发光法检测DNA的氧化损伤。主要包括以下三个部分:1.[Ru(bpy)_2dppz]~(2+)(简称Ru-dppz)的合成及其与DNA的相互作用:首先利用1,10-邻菲罗啉5,6-二酮与邻苯二胺反应制备联吡啶体配合物二吡啶[3,2-a;2',3'-c]吩嗪(Dppz),产物Dppz再与顺-双(2,2'-二吡啶基)二氯化钌(II)二水合物(Ru(bpy)_3Cl_2)反应制备二联吡啶二吡啶[3,2-a;2',3'-c]吩嗪钌,Ru-dppz。接下来,分别用紫外-可见光谱法、核磁共振波谱法和质谱法对产物Ru-dppz进行结构表征。再对合成产物Ru-dppz与DNA相互作用的荧光性质进行了详细研究。结果显示,随着DNA的加入Ru-dppz荧光强度逐渐增加,说明Ru-dppz可以作为DNA分子“光开关”。通过荧光滴定实验得到Ru-dppz与DNA的结合常数为1.5×10~7L/mol,结合比为0.14,与文献报道基本一致。2.选用上步合成的Ru-dppz为信号探针,建立一种无标记的电化学发光法检测Fenton试剂造成的DNA氧化损伤。基于DNA糖基化酶Fpg(E.coli formamidopyrimidine)的双功能性质(识别和切除8-oxodGuo,水解磷酸二酯键形成切口),因此通过引入Fpg放大DNA的氧化损伤,实现DNA氧化损伤的高灵敏检测。首先,考虑到Ru-dppz的电化学和电化学发光行为,选择还原的氧化石墨烯(r-GO)纳米金(Au)复合纳米材料修饰的氧化铟锡(ITO)电极为基底电极,再将DNA组装到电极表面,结合Ru-dppz产生电化学发光信号,通过检测电化学发光信号的改变实现DNA的氧化损伤的检测。同时,我们还通过琼脂糖凝胶电泳实验、荧光实验以及选择性实验等证明了我们的实验设计与原理。在最优条件下,该方法可以检测到10 nM Fe~(2+)/40 nM H_2O_2的Fenton试剂对DNA造成的损伤,检测灵敏度比类似的光电检测方法提高了1000倍。本方法为DNA氧化损伤的高灵敏检测提供了一种简便、灵敏的方案。3.为了进一步验证Fpg放大DNA氧化损伤的普遍适用性,我们研究了环境中另一种有害物质孟加拉玫瑰红对DNA造成的损伤。与Fenton反应造成DNA氧化损伤机理不同的是:孟加拉玫瑰红在光照作用下可以产生单线态氧。当DNA暴露于单线态氧时,由于单线态氧的能量较低,它能够损伤具有最低氧化电位的鸟嘌呤(G),且8-oxodGuo是其主要的损伤产物。采用DNA糖基化酶Fpg特异性识别并剪切8-oxodGuo的原理,检测微量孟加拉玫瑰红对DNA造成的氧化损伤,并研究了Fpg酶的特异性,结果显示该方法可以检测到0.1μg/mL的孟加拉玫瑰红造成的DNA损伤。
【学位授予单位】：成都理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q503;O657.1
【图文】：

图 2-3 Ru-dppz 核磁共振氢谱图（溶剂为 CD3CN）Fig.2-3 Nuclear magnetic resonance hydrogen spectroscopy of Ru-dppz (solvent CD3CN)图 2-4 Ru-dppz 核磁共振氢谱图（放大）Fig 2-4. Nuclear magnetic resonance hydrogen spectroscopy of Ru-dppz (magnified)

17图 2-4 Ru-dppz 核磁共振氢谱图（放大）-4. Nuclear magnetic resonance hydrogen spectroscopy of Ru-dppz (magdppz 的紫外-可见吸收光谱图研究了 Ru-dppz 的紫外-可见吸收光谱，并对 Ru-dppz 与 DN Ru-dppz 与 DNA 都是溶解于 PB 溶液，所以使用 PB 为空测定，所得吸收光谱图如下。

图 2-5 Ru-dppz 与 DNA 相互作用前后的紫外可见吸收光谱图ig.2-5 Ultraviolet-visible absorption Spectra of Ru-dppz (a)；DNA (b)；and Ru-dppz +DNA (由于如图 2-5 所示，曲线 a 显示 Ru-dppz 在 281 nm、368 nm、440 nm 分现 3 个吸收峰，与所参考文献紫外吸收光谱图的吸收峰一致（Amouyal et a990）。如曲线 b 所示为 DNA 的紫外吸收光谱，在 260 nm 处有一个很明显收峰。如曲线 c 所示，为 DNA 与 Ru-dppz 的混合液，分别在 260 nm、281 nm68 nm、440 nm 处出现吸收峰，再次证明我们所合成的 Ru-dppz 制备成功。由于Ru-dppz在440 nm处的摩尔吸光系数为ε=14000 L/（mol· cm），DNA60 nm处的摩尔吸光系数为6600 L/（mol· cm），分别对Ru-dppz和DNA进行浓正。DNA浓度以碱基对的摩尔浓度计，DNA的浓度按下式计算：[DNA]=K·A260/6600（M） （2-1式中K为稀释倍数。测量DNA吸光度时，如DNA浓度过高，可导致吸光度测准，一般应稀释到A在0.5~1之间较为合适。配置好的DNA应在冰箱中保存备。同理，根据朗伯比尔定律计算得到Ru-dppz的浓度。

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