基于细菌全基因组技术对AMDY2-9-2的氧化硫能力研究

发布时间：2020-08-26 04:38

【摘要】：AMDY2-9-2由安徽铜陵酸性矿水样品中分离纯化得到。安徽铜陵废矿区环境具有含铁硫化矿物,重金属含量高,pH低等特征,酸性矿区环境形成的原因一方面源自于含硫化物化学反应,另一方面可能源自于矿区微生物群落氧化硫产生的S042-等酸性硫化物。因此,为了研究硫氧化微生物在酸性环境形成中的作用,本实验以AMDY2-9-2为研究对象,利用细菌全基因组技术,重点研究AMDY2-9-2的硫氧化能力。在通过De novo全基因组技术获得AMDY2-9-2全部基因后,利用现有通用数据库,对基因进行注释,由此可获得AMDY2-9-2硫氧化基因及其可能的硫氧化通路;此外,通过比较基因组的手段,将AMDY2-9-2基因与典型硫氧化菌株做共线性,基因家族等信息分析,获得AMDY2-9-2硫氧化基因可能的定位,作用方式及进化等信息,为深入的实验研究指明方向。根据AMDY2-9-2全基因组的结果,通过在其培养环境中添加不同浓度,不同粒径的单质硫以研究其对单质硫的氧化情况,此外,通过改变AMDY2-9-2与单质硫的接触方式以及培养环境中电子受体,研究其氧化单质硫的方式以及硫氧化功能蛋白的作用途径。通过这一系列针对AMDY2-9-2硫氧化能力的研究,旨在发现其氧化硫的方式及关键环节。希望通过后期人为干预的方式减缓其硫氧化进程,以此达到缓解及治理矿区环境酸化现象。在经GOG,GO及KEGG数据库注释及比较基因组的生物信息分析后,AMDY2-9-2基因数据显示出了其独立的硫氧化基因体系,但并未显示出独立的铁还原基因体系;与铁代谢有关的基因多以铁硫簇的形式存在。这就表明,AMDY2-9-2的铁还原功能与硫代谢功能可能是偶联的。此外,AMDY2-9-2中编码铁硫代谢过程的基因同时也编码其他生理过程,如氨基酸代谢,碳循环等,因此,在菌株存在的环境中所发现的如SO42-,Fe2+等指征硫氧化及铁还原的标记物,并不完全意味着AMDY2-9-2即具有硫氧化-还原铁偶联能力,因这些物质亦有可能是其他生理过程的中间产物。因此,只有结合了基因水平的实验结果与理化实验结果,才可最终确认AMDY2-9-2的铁硫代谢功能。在生理生化实验部分,我们以菌体生长量,pH,Eh,SO42-以及Fe2+浓度来表征和衡量单质硫的氧化程度及单质硫氧化-铁还原的偶联程度。研究结果显示,当培养基中单质硫添加量小于等于6g/L时,AMDY2-9-2对单质硫的氧化能力与单质硫添加量呈正相关;当添加同样浓度的单质硫时,所添加的单质硫粒径越小,AMDY2-9-2对单质硫的氧化程度越高。研究AMDY2-9-2氧化单质硫的作用方式的实验结果表明,AMDY2-9-2氧化单质硫时,AMDY2-9-2必须与单质硫有直接或间接的接触,并且只有在菌体完整且具有生物活性的条件下才能参与单质硫的氧化过程;此外,在硫氧化过程中,氧和Fe3+这两种电子受体可同作为电子受体而参与到单质硫的氧化过程,但相比于Fe3+,氧是AMDY2-9-2氧化单质硫的更高效电子受体;该实验结果说明,在缺乏氧受体的情况下,Fe3+是能够作为代替的电子受体参与硫氧化过程,换言之,在乏氧情况下,AMDY2-9-2具有硫氧化-铁还原偶联功能。
【学位授予单位】：南京大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q811.4
【图文】：

模式图,硫循环,酸性矿,模式图

程进入大气，随后大气中的硫以降水、沉降及表面吸收等作用，再回到陆地与海逡逑洋，并最终随着地表径流进入河流，输往海洋，沉积于海底，循环往复，完成能逡逑量交换［４＿５］。全球硫循环模式图如图１．１所示【６１。结合上述的结论，硫在海陆之间逡逑的循环不仅仅是个物理化学过程，同时还有赖于生物的作用。有文献指出，具有逡逑硫代谢功能的生物可通过还原作用生成硫化氢，随后，硫化氢可与环境中的铁离逡逑子等金属离子反应，并形成硫化物（大部分为ＦｅＳ２）。一部分暴露于氧气中的硫化逡逑物可被重新氧化为硫酸盐，而未被氧化的硫化物则通过沉积作用与有机质中有机逡逑硫化合物共同进入到地质储库对于一切生物而言，硫是多种氨基酸的组成逡逑部分，一些半必需／必需氨基酸，如甲硫氨酸，半胱氨酸，胱氨酸等，是构成生命逡逑体正常功能必不可少的物质；一些无机自养微生物可以硫为营养物质，通过对硫逡逑的氧化还原过程而获能生存

硫循环,还原态硫,完全氧化,硫代硫酸盐

自养型菌株为主，以及某些厌氧光合自养菌和古生菌；三为硫酸盐类的还原过程逡逑【３１１，三种硫循环过程如图１．２所示。图中，蓝色箭头表示异化硫酸盐还原作用，逡逑黑色箭头表示异化作用，紫色箭头表示脱硫过程，绿色箭头表示同化硫酸盐还原逡逑作用，红色箭头表示异化型硫氧化作用ｔ３２１。这三种硫循环过程，最终均会产生含逡逑Ｓ0４２？的终产物，造成矿区周边环境酸化。逡逑图１．２微生物参与硫循环图（引自胡欣等，２０１８）逡逑以矿区丰度较大的嗜酸性硫氧化硫杆菌为例，它既可将环境中的还原态硫化逡逑物部分氧化，生成亚硫酸盐和硫代硫酸盐等中间产物，也＂了完全氧化硫化物而生逡逑成硫酸盐，使周围环境酸化［３３—３４］。无论是部分氧化还是完全氧化，它均可使硫化逡逑物从“还原态”转变为“氧化态”

质量分布图,测序,零模,随机分配

逦３００逡逑Ｐｏｓｉｔｉｏｎ邋ａｌｏｎｇ邋ｒｅａｄｓ逡逑图２．１邋Ｉｌｌｕｍｉｎａ测序碱基分布图逡逑Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｑｕａｌｉｔｉｅｓ逡逑４－５逦ｉ逦ｉ逦ｉ逦ｉ逦ｉ逦ｉ逡逑４０逡逑３５邋－逡逑３０逦－逦－逡逑＞ｓ逦２５逦－逡逑＂ｃｏ逡逑８逦２０逦－逦－逡逑１５逦－逦－逡逑１０逦－逦－逡逑５逦－逦－逡逑０逦；逦ｉ逦，逦ｉ逦，逦，逦：逡逑０逦５０逦１００逦１５０逦２００逦２５０逦３００逡逑Ｐｏｓｉｔｉｏｎ邋ａｌｏｎｇ邋ｒｅａｄｓ逡逑图２．２邋Ｉｌｌｕｍｉｎａ测序质量分布图逡逑２．２．２邋Ｐａｃｂｉｏ邋数据逡逑（ｉ）数据概况逡逑由于ＰａｃＢｉｏＲＳＩＩ平台上单个ＳＭＲＴｃｅｌｌ中有１５万个零模波导孔（Ｚｅｒｏ－Ｍｏｄｅ逡逑Ｗａｖｅｇｕｉｄｅｓ，邋ＺＭＷｓ），当测序时ＤＮＡ模板随机分配到每个ＺＭＷ小孔会存在

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