嗜热菌Anoxybacillus来源的α-淀粉酶的酶学性质分析及其热定性改造研究
发布时间：2020-08-26 11:13
【摘要】：不同生境中各具特性酶的挖掘,一方面要满足不同的应用条件对酶的催化活性、酸碱耐受性、热稳定性、氧化稳定性、有机溶剂耐受性、立体异构选择性等的特定要求;另一方面则丰富和扩展人们对酶的各种机制的认识,以便能更好地开发甚至创造符合要求的酶。Anoxibacillus sp.主要分布于火山温泉、堆肥等热环境中,为嗜热碱性菌,相应地,来源于Anoxybacillus sp.的蛋白,具有耐热和嗜碱的特性,这使Anoxybacillus sp.成为重要的微生物资源,在生物质能源、环境污染物处理等方面发挥重要作用。本研究通过对来源于温泉环境的Anoxibacillus sp.GXS-BL的α-淀粉酶的生化特性的分析研究,发现Ca2+能提高该酶的热稳定性,Zn2+抑制其活性,在B结构域进行的突变改造降低其热稳定性和活性,由此进行的相关热力学、动力学等方面的机理分析研究,不仅有助于对该酶的认识和利用,获得的理论和实验认识,还可以用于指导其他工业酶的开发与应用。主要研究结果如下:采用淀粉作为单一碳源的M9培养基,从腾冲温泉土壤中筛选到产淀粉酶的菌株Anoxybacillus sp.GXS-BL,通过序列比对和基因步移扩增,获得该菌株的α-淀粉酶基因AGXA。将AGXA与表达载体pQE30连接,导入大肠杆菌M15中表达,对表达产物进行分离纯化和酶学性质分析。结果表明,AGXA对可溶性淀粉催化水解反应的最适反应pH为8.0,最适反应温度Topt为60 ℃,热半失活温度T50为63.3 ℃,熔解温度Tm为67.3 ℃,在70℃时的半衰期t1/2小于5min,是中等耐温碱性酶。Vmax、Km、Kcat、Kcat/tm分别为0.933×10-5 M.L-1.S-1、3.43 g.-1 2.54×102s-1、74.10 s-1g-1L;对有机溶剂和活性剂具有较强的耐受性。Na+、K+对AGXA有激活作用,Mg2+、Ca2+对该酶的活性影响不明显,Cu2+、Co2+、Fe3+明显抑制该酶的活性,Zn2+则完全抑制其活性。Ca2+提高AGXA的热稳定性。在Ca2+存在下,AGXA的最适反应温度Topt为70 ℃,AGXA的热半失活温度T50为73.8 ℃,在70 ℃时的半衰期t1/2大于200 min,熔解温度Tm 为77.8 ℃。圆二色性分析表明,在常温下,Ca2+的加入,并不改变AGXA的二级结构,只是使其结构更紧凑。在升温过程中,没有Ca2+的AGXA在60℃以内,维持着相对稳定的二级结构,随着温度的升高,二级结构逐渐改变,其结构变化主要发生在60-70℃范围内,到70 ℃后,结构变化结束;吸收信号值则随温度升高持续增大,表明蛋白在去折叠后聚集,但没有发生沉淀。加Ca2+后,AGXA的CD谱图发生变化的温度范围为70-80 ℃;吸收信号随温度升高先增大,然后下降,表明含Ca2+的AGXA在热去折叠后,先聚集后沉淀。差示扫描量热分析表明,有Ca2+的AGXA的热容变化发生在70℃,在77.8 ℃达最大值,热去折叠过程△H为164.7 kcal.M-1,热容变化值△Cp为1.35 kcal.M-1℃-1;不加Ca2+时,AGXA在60 ℃时热容升高,在67.3 ℃达最高,AH为133.0kcal.M-1,△Cp为1.83kcal.M-1℃-1。加Ca2+的AGXA通过增大热去折叠过程中的焓变化值△H、降低热容变化值△Cp来提高其热稳定性。Zn2+抑制AGXA的活性。金属离子对酶活性影响的实验表明,Zn2+与AGXA在40 ℃作用30 min后完全抑制其活性;圆二色性实验表明,Zn2+与AGXA作用后,酶的二级结构发生明显变化,不再具备原有的构型。采用量子化学方法,对组氨酸在蛋白质中的多重作用进行能量计算的结果表明,His-Zn2+形成的配位键能和阳离子-π相互作用能远远高于氢键和范德华相互作用能。采用分子动力学模拟,发现Zn2+不仅能与AGXA中保守的His217形成配位键,还能与Phe178形成阳离子-π相互作用,从而使Phe178的二面角C-CA-CB-CG维持在平面角构象,关闭AGXA的活性口袋,抑制其活性。对AGXA开展了不同温度的分子动力学模拟,结果表明,AGXA在400 K时的构象变化大于350 K的,氨基酸残基偏离平衡位置明显的主要在B结构域。根据350 K与300 K的△RMSF值,对AGXA进行热稳定性改造的突变位点选取;基于能量计算,对选取位点进行虚拟饱和突变分析,选取替换氨基酸;定点突变实验验证;发现D358I提高酶的热稳定性,在B结构域进行的其它突变改造降低酶的活性和热稳定性。
【学位授予单位】：广西大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q936
【图文】：
含有１个希腊钥匙模体。Ｂ结构域和Ｃ结构域分别位于Ａ结构域的两侧％。逡逑ｍＭ逡逑图１－２淀粉酶的三维结构（ＰＤＢ邋：邋１ＢＬ丨）丨８丨逡逑绿色为Ａ结构域，洋红色为Ｂ结构域，蓝色为Ｃ结构域，钙和钠离子分别为红色和橙色的小球，活逡逑性氨基酸Ａｓｐ２３１，Ｇｌｕ２６１和Ａｓｐ３２８用红色表示，连接ｐ７和ｃｔ７的环用黄色表示逡逑Ｆｉｇ邋１邋－２邋Ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ａ－ａｍｙｌａｓｅ邋（ＰＤＢ邋ｃｏｄｅ邋１ＢＬＩ）逡逑Ｄｏｍａｉｎ邋Ａ邋ｉｓ邋ｓｈｏｗｎ邋ｉｎ邋ｇｒｅｅｎ，邋ｄｏｍａｉｎ邋Ｂ邋ｉｓ邋ｓｈｏｗｎ邋ｉｎ邋ｍａｇｅｎｔａ邋ａｎｄ邋ｄｏｍａｉｎ邋Ｃ邋ｉｓ邋ｓｈｏｗｎ邋ｉｎ邋ｃｙａｎ．邋Ｃａｌｃｉｕｍ邋ｉｏｎｓ逡逑ａｎｄ邋ｓｏｄｉｕｍ邋ｉｏｎｓ邋ａｒｅ邋ｓｈｏｗｎ邋ａｓ邋ｒｅｄ邋ｓｐｈｅｒｅｓ邋ａｎｄ邋ｏｒａｎｇｅ邋ｓｐｈｅｒｅｓ邋ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．邋Ｔｈｅ邋ａｃｔｉｖｅ邋ｓｉｔｅ邋ｒｅｓｉｄｕｅｓ邋Ａｓｐ２３１，逡逑Ｇｌｕ２６１邋ａｎｄ邋Ａｓｐ３２８邋ａｒｅ邋ｓｈｏｗｎ邋ｉｎ邋ｒｅｄ．邋Ｔｈｅ邋ｌｏｏｐ邋ｃｏｎｎｅｃｔｉｎｇ＾邋ｔｏ邋ａ７邋ｉｓ邋ｓｈｏｗｎ邋ｉｎ邋ｙｅｌｌｏｗ逡逑ａ－淀粉酶采用对异头碳原子构象保留的方式切割ｃｄ—４糖苷键，形成具ａ构型的产逡逑物，其催化机制包括三个步骤，第一步，底物淀粉链中的糖苷氧被质子供体（Ｇｌｕ２６１）逡逑质子化，－１亚位上的葡萄糖残基的Ｃｌ被催化亲核体（Ａｓｐ２３１）进行亲核攻击，糖^u键逡逑断裂
４０°Ｃ邋－邋Ｉ－逡逑ｏ逡逑图１－４嗜热菌及其最适生长温度ｌ１６］逡逑Ｆｉｇ邋１－４邋Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ邋ｔｒａｃｔａｂｌｅ邋ｅｘｔｒｅｍｅ邋ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ邋ａｎｄ邋ｔｈｅｉｒ邋ｏｐｔｉｍｕｍ邋ｇｒｏｗｔｈ邋ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ．逡逑Ａｎｙ邋ｏｒｇａｎｉｓｍ邋ｗｉｔｈ邋ａｎ邋ｏｐｔｉｍｕｍ邋ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ邋ａｂｏｖｅ邋４５邋°Ｃ邋ｉｓ邋ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ邋ａｓ邋ａ邋ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ，邋ｂｕｔ邋ｔｈｉｓ邋ｒａｎｇｅ逡逑ｉｓｅｘｔｒｅｍｅｌｙ邋ｂｒｏａｄ邋ａｎｄ邋ｅｘｔｅｎｄｓ邋８０邋°Ｃ邋ｕｐ邋ｔｏ邋ｔｈｅ邋ｕｐｐｅｒ邋ｌｉｍｉｔ邋ｏｆ邋ｌｉｆｅ．邋Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，邋ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ邋ｈａｖｅ邋ｂｅｅｎ邋ｆｕｒｔｈｅｒ逡逑ｓｕｂｄｉｖｉｄｅｄ邋ｉｎｔｏ邋ｍｏｄｅｒａｔｅ邋ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ邋ｔｈａｔ邋ｇｒｏｗ邋ｏｐｔｉｍａｌｌｙ邋ｂｅｔｗｅｅｎ邋４５邋ａｎｄ邋７０邋°Ｃ，邋ｅｘｔｒｅｍｅｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ逡逑ｔｈａｔ邋ｇｒｏｗ邋ｏｐｔｉｍａｌｌｙ邋ａｔ邋７０邋°Ｃ邋ａｎｄ邋ａｂｏｖｅ，邋ａｎｄ邋ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ邋ｔｈａｔ邋ｇｒｏｗ邋ｏｐｔｉｍａｌｌｙ邋ａｔ邋８０邋°Ｃａｎｄ邋ａｂｏｖｅ逡逑５逡逑
幔rP槎ǚ勖傅拿秆绠灾史治黾捌淙任榷ㄐ愿脑煅芯浚]3?Ｃｐ与温度Ｔ的曲线积分为量热焓（Ａ／／），两端基线的差值为ＡＣＶ４５］，如图１－６所示。逡逑６０邋逦逦逦逦逦逡逑１５０邋—逦Ａ逡逑ＵＪ逡逑－ＩＱ逦Ａ．，，１．邋．１邋，．Ａ邋ｎｌｎ．Ａ，．，！邋？Ｉ．ｍ邋１？邋１．邋ｔｎｌ邋ｎｌ邋１邋，Ａ！邋■邋ｔ．．ｌ，．邋Ａ．Ｉ邋Ａ，逦Ｉ邋．邋Ｉ邋ｔｌ＿ＪＬ＿逡逑２０逦３０逦４０逦５０逦６０逦７０逦８０逦９０逦丨邋００逡逑Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ邋（＊Ｃ）逡逑图１－６蛋白的双态去折叠ＤＳＣ图示丨４３】逡逑Ｆｉｇ邋１－６邋ＤＳＣ邋ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ邋ｆｏｒ邋ｔｈｅ邋ｔｗｏ－ｓｔａｔｅ邋ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ邋ｏｆ邋ａ邋ｇｌｏｂｕｌａｒ邋ｐｒｏｔｅｉｎ逡逑己知Ａ／／、ＡＣ’Ｐ，可由以下公式计算蛋白的吉布斯自由能ＡＧ和熵值ＡＳ。逡逑ＡＧ邋＝邋Ａ／７邋（１邋－邋Ｄ邋－邋ＡＣｐ（（ｒｍ邋－邋７０邋＋邋ｎｎ邋（Ｄ逦（１＇２）逡逑ＡＧ邋＝邋Ｇｕ邋－邋ＧＦ邋＝邋ＡＨ邋－邋ＴＡＳ逦（１－３）逡逑当ｒ＝ｒｍ时，ａｇ＝ｏ，热焓变化ａ／／和熵变化ａｓ的作用相互补偿，处于折叠和去折叠逡逑状态的蛋白含量相等，蛋白处于这两者的动态平衡中［４６１。逡逑ＤＳＣ是一种强大的研究蛋白热变性的方法，不仅适用于可逆变性蛋白，也适用于不逡逑可逆热变性蛋白｜４７］。已有大量研究采用ＤＳＣ进行蛋白热变性过程分析，揭示蛋白的热逡逑稳定性机制［４８＿５（）］。逡逑（２）圆二色性（ＣＤ）逡逑圆二色性是物体对左旋和右旋圆偏振光的吸收差异Ｐ｜］。蛋白质的二级结构可由ＣＤ逡逑光谱的远紫外光谱区（１９０－２６０ｎｍ）确定
本文编号：2805101
【学位授予单位】：广西大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q936
【图文】：
含有１个希腊钥匙模体。Ｂ结构域和Ｃ结构域分别位于Ａ结构域的两侧％。逡逑ｍＭ逡逑图１－２淀粉酶的三维结构（ＰＤＢ邋：邋１ＢＬ丨）丨８丨逡逑绿色为Ａ结构域，洋红色为Ｂ结构域，蓝色为Ｃ结构域，钙和钠离子分别为红色和橙色的小球，活逡逑性氨基酸Ａｓｐ２３１，Ｇｌｕ２６１和Ａｓｐ３２８用红色表示，连接ｐ７和ｃｔ７的环用黄色表示逡逑Ｆｉｇ邋１邋－２邋Ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ａ－ａｍｙｌａｓｅ邋（ＰＤＢ邋ｃｏｄｅ邋１ＢＬＩ）逡逑Ｄｏｍａｉｎ邋Ａ邋ｉｓ邋ｓｈｏｗｎ邋ｉｎ邋ｇｒｅｅｎ，邋ｄｏｍａｉｎ邋Ｂ邋ｉｓ邋ｓｈｏｗｎ邋ｉｎ邋ｍａｇｅｎｔａ邋ａｎｄ邋ｄｏｍａｉｎ邋Ｃ邋ｉｓ邋ｓｈｏｗｎ邋ｉｎ邋ｃｙａｎ．邋Ｃａｌｃｉｕｍ邋ｉｏｎｓ逡逑ａｎｄ邋ｓｏｄｉｕｍ邋ｉｏｎｓ邋ａｒｅ邋ｓｈｏｗｎ邋ａｓ邋ｒｅｄ邋ｓｐｈｅｒｅｓ邋ａｎｄ邋ｏｒａｎｇｅ邋ｓｐｈｅｒｅｓ邋ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．邋Ｔｈｅ邋ａｃｔｉｖｅ邋ｓｉｔｅ邋ｒｅｓｉｄｕｅｓ邋Ａｓｐ２３１，逡逑Ｇｌｕ２６１邋ａｎｄ邋Ａｓｐ３２８邋ａｒｅ邋ｓｈｏｗｎ邋ｉｎ邋ｒｅｄ．邋Ｔｈｅ邋ｌｏｏｐ邋ｃｏｎｎｅｃｔｉｎｇ＾邋ｔｏ邋ａ７邋ｉｓ邋ｓｈｏｗｎ邋ｉｎ邋ｙｅｌｌｏｗ逡逑ａ－淀粉酶采用对异头碳原子构象保留的方式切割ｃｄ—４糖苷键，形成具ａ构型的产逡逑物，其催化机制包括三个步骤，第一步，底物淀粉链中的糖苷氧被质子供体（Ｇｌｕ２６１）逡逑质子化，－１亚位上的葡萄糖残基的Ｃｌ被催化亲核体（Ａｓｐ２３１）进行亲核攻击，糖^u键逡逑断裂
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本文编号：2805101
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