家蚕雌激素相关受体（BmERR）参与调节糖酵解并影响家蚕胚胎发育的研究

发布时间：2020-08-26 13:44

【摘要】：雌激素相关受体(ERR)作为转录因子家族的一员,参与调控许多重要的生命进程。在哺乳动物中,ERR与能量代谢和癌症相关,它也被作为乳腺癌和宫颈癌等相关癌症的检测靶标。在果蝇中,ERR可以作为能量代谢的开关来调节果蝇的发育过程。在家蚕中,目前已鉴定和克隆到了家蚕ERR基因(BmERR),并报道了BmERR可以参与调控卵黄原蛋白基因的表达。那么在家蚕中,BmERR除了参与调控卵黄原蛋白基因的表达,是否还存在其它的功能呢?本研究以家蚕胚胎发育过程这个能量代谢旺盛时期为切入点,对BmERR在家蚕胚胎发育时期的功能进行了研究,结果如下:(1)家蚕胚胎发育过程中BmERR和糖代谢相关基因的表达分析本研究首先通过RT-PCR和Western blot检测了BmERR在家蚕胚胎时期的转录水平和蛋白水平的表达特征,证实了BmERR在家蚕胚胎时期是有蛋白表达的,暗示着其可能存在着一定的生物学功能。为了研究BmERR对能量代谢的影响,本研究同时检测了糖酵解过程中磷酸果糖激酶(BmPFK)、己糖激酶(BmHK)和丙酮酸激酶(BmPK)三个限速酶基因的表达谱。分析发现,BmERR与上述三个糖酵解限速酶的表达趋势很相似,预示着它们之间可能存在着一定的关联性。(2)BmERR对糖酵解相关基因表达的影响为了验证BmERR与BmPFK、BmHK和BmPK三个限速酶基因的关系,本研究通过过表达、干涉、抑制剂处理三种方式来改变BmERR的表达量,并分析下游糖酵解限速酶是否发生变化。首先,在BmE细胞上过表达BmERR以后,qRT-PCR检测发现糖酵解中的三个限速酶基因都显著上调;然后,通过干涉BmERR和抑制剂处理细胞,qRT-PCR检测却发现三个限速酶基因显著下调。表明BmERR的表达量的变化会直接影响到BmHK、BmPK和BmPFK基因的表达变化。除了在细胞上干涉BmERR外,我们在蚕卵个体上也做了初步的干涉实验。将干涉双链dsBmERR和对照dsEGFP以浓度为1000 ng/μL的剂量分别注射到刚产下的蚕卵中,到蚕卵中的双链最终浓度大约为3 ng/粒。当对照组在产卵后第13天时,孵化率达到67.5%;而实验组需要在产卵后第14天才达到64.1%左右。表明在家蚕胚胎发育时期干涉BmERR可以延迟家蚕胚胎发育一天的时间,但不会出现致死。在家蚕产卵后第4天时,对其葡萄糖的含量进行了检测。结果表明,注射了dsBmERR的蚕卵葡萄糖的含量有显著性升高相比与对照组。同时,当胚胎发育到点青时提取总RNA并反转成cDNA用于定量分析,qRT-PCR分析显示,dsBmERR干扰会使BmHK、BmPK和BmPFK三大限速酶基因的表达显著下调。这些结果表明,BmERR可能通过影响糖酵解途代谢径来影响家蚕的胚胎发育。(3)BmERR影响胚胎发育的分子机制为了探究BmERR作为转录因子是否通过调节限速酶基因启动子的活性来影响糖酵解限速酶的表达?本研究利用JASPAR软件分析了BmHK、BmPK和BmPFK基因的启动子序列并预测了ERRE元件,在它们的启动子上都预测到了ERRE元件。本研究根据前面干涉和表达谱分析选择了具相关性更好的基因BmPFK进行了分析。首先,构建了一系列突变不同ERRE位点的pGL_3-BmPFKP细胞转染载体。然后,利用双荧光素酶报告系统,分析了调控元件对BmPFK基因启动子活性的影响,结果表明,ERRE-like1元件突变后,未检测到启动子活性变化。然而,突变ERRE-like2元件能够显著降低启动子的活性。本研究进一步在家蚕胚胎细胞系BmE-SWU1细胞系中过表达BmERR,检测了ERRE-like2元件对启动子活性的影响,结果表明ERRE-like2对启动子的活性有显著上调作用。为了确定BmERR蛋白是否直接结合在BmPFK基因启动子的ERRE-like2元件上发挥作用,本研究将生物素标记的ERRE-like2探针与重组BmERR DNA结合结构域(BmERR DBD)蛋白一起孵育,通过凝胶迁移实验(EMSA)检测,结果显示有滞后条带;当改变探针和蛋白的浓度时,条带信号的强度也随之改变;同时加入突变时,没有出现滞后条带。表明它们之间可以特异结合。同时利用ChIP实验,也验证BmERR可以结合在BmPFK基因启动子的ERRE-like2元件。以上结果表明,BmERR可以结合在糖酵解限速酶基因启动子上的ERRE元件上,直接调控糖酵解限速酶基因的表达,从而参与家蚕胚胎的发育。家蚕作为模型昆虫,本研究的数据将进一步促进ERRs与生长发育以及能量代谢之间的理解奠定基础。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q418
【图文】：

生活史,家蚕,滞育期

图 1.1 家蚕的生活史[1]Figure 1.1 Life history of silkworm[1]，卵有越年卵和非越年卵之分。非越年卵产下天便孵化而出。但是越年卵产下后，约一星期入一个停滞发育的“滞育期”。胚胎在滞育期间温度下，也不会向前发育，必须在一定的条件除后才能孵化[2-4]。滞育卵的耗氧量很低，同

示意图,示意图,家蚕,熟蚕

西南大学硕士学位论文体开始收缩，第五至第六节腹面透明，食叶减少，排出软粪和蚕尿，体呈蜡黄半透明状，开始吐丝，此时的蚕称为熟蚕，熟蚕即可上蔟吐丝结茧。家蚕多数种吐丝结成的茧为白色，也有吐丝结成红色、黄色、粉红色、蓝色等彩色茧的系。经过 2～3 天，蚕吐完丝后便在茧内化成蛹。家蚕在蛹期要把幼虫的组织器加以降解、重塑最终发育为成虫的器官。成虫形成完成后，脱去蛹皮，羽化为虫，破茧而出。在成虫期，不从外界取食，具有发达的生殖器官，交配产卵后约经过一星期左右自然死亡，家蚕的一个世代就此告终[6]。1.1.1 家蚕的胚胎发育过程家蚕作为鳞翅目模式昆虫，对家蚕的胚胎发育最早进行研究的是 Tichomir(1886)，家蚕的卵呈椭圆形,长约 1.3 mm，宽约 1.05 mm，厚约 0.6 mm，1 g 卵大有 1800-2100 粒[7]。非滞育卵胚胎的发育主要经过受精期、原核分裂期、胚盘形期、胚带形成期、原肠化期和反转期等。家蚕非滞育卵胚胎发育的主要过程[8]图 1.2。

结构特征,转录因子,文献综述

第 1 章文献综述赋予同时受体二聚化和 DNA 结合所必需的蛋白质柔韧性；含有与共用的 C 末端 AF-2 结构域的 LBD （图 1.3A）。ERR 作为转录因子，RE 元件的核心序列为“GGTCA” （图 1.3 B），同时它可以单体的形结合，也可以形成同源二聚体，还可以与其它的转录因子结合形成式发挥作用(图 1.3 C )[35-37]。

【参考文献】