高活性核桃内生真菌筛选及其代谢产物抑菌机理研究（Ⅱ）

发布时间：2020-08-26 18:18

【摘要】：核桃内生真菌具有丰富的生物多样性,为了更好地利用这种微生物资源,本研究在核桃内生真菌活性菌株筛选、发酵条件优化、代谢产物分离纯化,以及抑菌机理等方面进行研究,主要结果如下:(1)采用生长速率法,以6种常见植物病原菌为指示菌,对16株核桃内生真菌进行活性筛选。结果表明,1株来源于良种核桃树根部的内生真菌G3,其发酵产物对6种病原菌均表现出一定的抑菌活性。其中对苹果腐烂病原菌抑制率达到100%,完全抑制了病原菌菌丝生长;对水稻纹枯、核桃炭疽病原菌抑制率均大于75%。通过形态学特征观察结合分子生物学鉴定,G3确定为弯角镰刀菌Fusarium camptoceras。(2)以接种量、发酵温度和发酵天数为影响因子,以G3发酵产物对苹果腐烂病原菌的抑制率为评价指标,通过单因素试验、正交试验对核桃内生真菌G3的发酵工艺条件进行优化。结果表明,G3发酵的最优工艺为:接种量10%,发酵温度28℃,发酵时间30 d;此工艺条件下,G3发酵产物对苹果腐烂病原菌抑制率为85.17%。影响因子对抑制率的影响依次为:发酵温度发酵天数接种量。(3)采用液液分配方法,对核桃内生真菌G3固体发酵产物的乙醇提取物依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别进行萃取。结果表明,正丁醇相和乙酸乙酯相对苹果腐烂病原菌抑制的IC_(50)值分别为3.3 mg/mL和4.3 mg/mL;结合各萃取相质量及其对苹果腐烂病原菌抑制效果综合考虑,选择正丁醇相和乙酸乙酯相作为深入研究的活性萃取相。(4)通过对各萃取相化学成分预试验,结果显示,正丁醇相主要含有有机酸类物质,乙酸乙酯相主要为酚类物质,推测G3发酵产物活性物质可能为有机酸与酚类物质。对乙酸乙酯萃取相进行柱色谱分离获得高活性组分Fry2-2,供试浓度为1 mg/mL时,对苹果腐烂病原菌抑制率达到89.36%;GC-MS分析共检测到15种化合物,主要为胺类、脂类、酚类与烷烃类。对Fry2-2进一步分离,在Fry2-2-2组分中析出化合物A,经过重结晶纯化和核磁共振等检测,化合物A鉴定为:2,2'-亚甲基双[6-(1,1-二甲基乙基)]-4-甲基-苯酚,抑制苹果腐烂病原菌的IC_(50)值为0.11 mg/mL。(5)在体外和体内条件下,对G3高活性组分抑制苹果腐烂病的机理进行研究。结果表明:高活性组分处理下,病原菌菌丝出现破损、撕裂,或者顶端形成纺锤形,使其生长异常,菌丝量减少;病原菌菌液的电导率增加、麦角甾醇含量降低、几丁质酶活性增加;感病苹果的体内防御酶SOD、PPO、POD活性均明显升高,高活性组分与5 mmol/L水杨酸两者处理效果相近,防御酶活性都呈现先升高后降低的趋势,并能够明显抑制苹果腐烂病斑的扩展,最大抑制率为77.61%。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS201.3;TS255.6
【图文】：

胡桃醌,萘醌类,三羟基苯,甲酰

云贵等地区（王伟等, 2007），除了黑龙江和南方沿海一些核桃分布（朱俊玲等, 2003; 陆俊等, 2014; 王丰俊和王建中韧，纹理美观，适宜制造高档用具，甚至在军事领域也有）。核桃被认为是生态先锋树种和生物质能源战略树种，在能力，在山丘、坡麓、梯田、堰边栽植有涵养水源、保持经济、生态和社会效益，因此引起了社会各界的广泛重视。植总面积已突破 200 万公顷，年坚果总产量超过 50 万吨，益。植物的化学成分研究物主要含有萘醌及其苷类、黄酮及其苷类、二芳基庚烷类类（naphthoquinones）1）、氢化胡桃醌及其苷是核桃青皮中的主要萘醌类物质，质，为橙色针状结晶，具有显著的杀虫、抑菌和抗癌等生止血、抑菌及治疗湿疹、牛皮癣等（闫克玉等, 1994）。

山奈酚,金丝桃苷,桑色素,黄酮类化合物

分别为大黄酚、大黄素甲醚、4'，8-二羟基-1-四氢萘酮。林君阳（果皮中分离得到1个萘醌类化合物，为5-羟基-2-甲氧基-1,4-萘醌。杨霞青皮中测定出胡桃醌含量为 0.84 mg/g，对马尾松溃疡病菌和核桃枝显，EC50分别为 102.751 mg/L、112.808 mg/L。Li 等（2008）和从胡桃科植物中分离到 5,8-二羟基-1,4 萘醌、α-萘和 5-羟基-3,3'-双衍生物。酮类（flavonoids）类化合物分布广泛于植物界，多以游离态或糖苷形式存在，主要有、抗氧化、抗菌及抗病毒等活性。黄酮醇及其苷类是核桃青皮中的，姚焕英等（2003）研究表明核桃属植物中的黄酮类化合物主要存中，主要包括樱花亭（7-甲基二氢山奈酚）、槲皮素（6）、山奈（8）、扁蓄苷（槲皮素-3-阿拉伯糖苷）、胡桃苷（山奈酚-3-阿拉及 taxifolin。此外还有学者发现核桃青皮中其他黄酮类物质，比如桑 2007）、5-羟基-3,7,3',4'-四甲氧基黄酮（10）（周媛媛等 2014）

酰基,咖啡酸,异构体,葡萄糖

王克建等（2009）发现核桃仁中包含鞣花酰基葡萄糖 4 种异构体、橡 2 种异构体、二鞣花酰基葡萄糖 2 种异构体、二没食子酰基葡萄糖 2 种花酰基和橡i\0酰基葡萄糖 3 种异构体。王金兰等（2008）在山核桃树皮二甲氧基鞣花酸，山核桃酚和 4,8-二羟基萘酚-1-O-β-D-[6'-O-(3",5"-二甲甲酰基)]吡喃葡萄糖苷等。万政敏等（2007）在普通核桃青皮中发现了、没食子酸、绿原酸、阿魏、咖啡酸、对羟基苯甲酸等酚类物质。其他成分宇彬等（2006）从核桃青皮中得到精制多糖 76.08%，粗多糖 38.07%。楸皮中还发现了咖啡酸、没食子酸、逆没食子酸、对羟基桂皮酸、琥1,2,6-三没食子糖和 1,2,3,6-四没食子糖。核桃楸青果皮中发现了对羟基草醛、咖啡酸及对羟基肉桂酸等（石建辉等, 2006; 刘元慧, 2009; 。马良进等（2009）用不同溶剂对山核桃外果皮甲醇浸膏进行萃取分离离得到 7 个化合物：乔松酮（20），黄卡瓦胡酵素（21），5-羟基-4',（22），5-羟基-2-甲氧基-1,4-萘醌（23），5-羟基-6,7-二甲氧基黄烷酮（25）。

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