小鼠胚胎干细胞中Etv5-Tet2-Fgfr2轴正反馈调控ERK磷酸化的机制研究

发布时间：2020-08-26 19:57

【摘要】：细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)活性的动态平衡被多重反馈环路调控以确保小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells,mESCs)正常的自我更新。以前的研究证明,在mESCs中存在多种阻止ERK磷酸化(pERK)过度激活的负反馈环路。但是,在mESCs中一直都不清楚是否存在正反馈环路来维持pERK的最低水平。有研究表明pERK进入细胞核后可以激活一系列的转录因子,包括Etv4、Etv5、Dusp6、Spry和Sef等。其中Dusp6、Spry和Sef作为负反馈调控来调节pERK的水平,而Etv4和Etv5是通过负反馈还是正反馈调控来维持pERK的水平并不清楚。本研究用CRISPR/Cas9对Etv5基因进行了敲除(KO),再根据Etv5敲低(KD)的RNA-seq数据,用qPCR、Western blot、生物信息学分析、启动子克隆、双荧光素酶检测和甲基化测序等实验进行检测,主要获得以下结果:1.用CRISPR/Cas9在mESCs中敲除Etv5本实验设计了一对特异靶向Etv5基因第7号外显子的sgRNA,将其通过分子克隆连接到PX459M载体中,通过基因敲除获得了Etv5 KO B10、B13和B23三株克隆。2.确立了Etv5和pERK之间的正调控关系在Etv5 KO的mESCs中pERK蛋白的表达水平降低。Etv5 KO mESCs的生长速度减慢、Otx2基因表达显著上调、细胞核可以被荧光染料Hoechst 33258深染。3.在mESCs中发现了Etv5-Tet2-Fgfr2轴介导的正反馈环路来调控pERK为了探索在Etv5 KO mESCs中导致pERK下调的分子机制,本研究分析了之前在mESCs中Etv5 KD的RNA-seq数据来确定FGF-ERK信号通路中哪个基因的表达既显著下调又能够使pERK去磷酸化,最终发现Fgfr2在Etv5 KD mESCs中不仅显著下调其表达丰度在mESCs中也比较高。在Etv5 KO mESCs中Fgfr2的mRNA和蛋白表达水平也都下降。为了进一步研究Etv5是怎样调控Fgfr2的表达,我们将生物信息学预测的Fgfr2启动子克隆到了PGL3载体中,双荧光素酶实验的检测结果发现与对照组相比过表达Etv5仅能产生大约两倍的荧光强度。为了探究Etv5是否通过其它因子的介导来调控Fgfr2的表达,我们使用Cistrome网站中的ChIP数据库,分析了结合在Fgfr2启动子区的转录因子,结果发现有43个转录因子结合在Fgfr2启动子区,而在这43个因子中Tet2在Etv5 KD后下调最显著。Tet2的mRNA和蛋白在Etv5 KO mESCs中的表达也都显著下降。我们又检测了Fgfr2启动子区的甲基化程度,结果发现在所检测的Fgfr2启动子区Etv5 KO后的甲基化程度为16.7%,而野生型J1细胞甲基化程度为2.5%。总之,我们在mESCs中发现了调控pERK的一个新模式,即Etv5促进Tet2的表达,而Tet2去甲基化Fgfr2启动子区从而促进Fgfr2的表达,Fgfr2反过来再继续激活ERK信号通路,这为理解早期胚胎发育过程中细胞命运决定提供了新的参考。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q75

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本文编号：2805622