水稻TGW6基因编辑检测方法比较研究

发布时间：2020-08-28 21:38

　　基因编辑技术已经成为生物学领域中最受欢迎的技术之一,针对基因编辑个体的筛选和鉴定的检测方法已经成为当今重要的研究内容。本研究基于实时荧光定量PCR(qPCR)平台开发了新的检测方法,以合成的9个质粒为样品材料,对qPCR方法进行灵敏度与特异性的检测,同时综合比较了已经报道的T7核酸内切酶I(T7E1)检测法、临界退火温度PCR(ACT-PCR)检测法和高分辨率熔解曲线(HRM)分析法。研究发现其它方法在时间、灵敏度、劳动力、成本以及序列的局限性,凸现了qPCR方法在这几个方面的优势。进一步的以南粳46、编辑TGW6基因的水稻为实验材料,利用qPCR与数字PCR的方法对基因编辑水稻样品进行检测与鉴定。主要研究结果如下:1.检测qPCR方法的灵敏度与特异性,利用双探针进行实验,研究显示该方法即使对于单碱基的缺失、插入和替换的DNA样品,依旧可以准确的检测出来。对于编辑TGW6基因的水稻样品的检测筛选,qPCR方法可以准确鉴定区分样品类型,通过2~(-△△CT)方法计算分析大量样本数据得到结果显示野生型、杂合型突变和纯合型突变相对应的值为1(1.16至0.80),0.5(范围从0.64到0.41)和0。2.利用T7E1检测法、ACT-PCR检测法与HRM分析法检测鉴定9个合成质粒的DNA样品,T7E1检测法进行酶切5个小时后,实验结果良好,单碱基突变体均被剪切出两条带且条带明显。在ACT-PCR检测法中将退火温度设定为73℃,凝胶电泳显示只有WT野生型出现条带的,而突变体均没有条带。HRM分析法同样适用于基因编辑的突变体的筛选,但是该筛选方法不能区分A-T型的单碱基替换。3.T7E1检测法与ACT-PCR检测法,在时间消耗上大于4小时,而HRM分析法在时间上的消耗小于2个小时。在灵敏度上与其他两种方法相比,T7E1检测法的灵敏度呈中等水平。ACT-PCR检测法与T7E1检测法因操作繁琐,所以人力成本很高,而HRM分析法在中等水平。相比较T7E1检测法与ACT-PCR检测法,HRM分析法在成本花费上比较高。ACT-PCR检测法有一定的序列局限性,而其他两种方法没有序列的局限性。4.利用数字PCR检测编辑TGW6基因的水稻,进一步的将qPCR方法延伸到ddPCR平台,扩展该方法的灵敏度,同时优化试验环节,该方法可以成功的区分野生型、杂合型突变、纯合型突变,结果目的基因/内参基因比值分别为0.999≈1、0.512≈0.5、0.0039≈0,实现方法升级。
【学位单位】：沈阳师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S511;Q943.2
【部分图文】：

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水稻 TGW6 基因编辑检测方法比较研究成，其中 32 个氨基酸都是保守的，只有第 12 位和第 13 位的氨基酸变化较大两个氨基酸被称为双氨基酸残基（Repeatvarible di-residues, RVDs），RVD 包冬酰胺—异亮氨酸（NI）、组氨酸—天冬氨酸（HD）、天冬酰胺—甘氨酸（以及天冬酰胺—天冬酰胺（NN），RVD 与碱基的对应关系为: NI 识别 A，NGT，NN 识别 G，HD 识别 C[39-40]。每个 TALE 单体只靶向 1 个核苷酸。在构建 TA人工酶时需要针对每一个靶位点的上下游各设计一个 TALE 识别模块，将两个识别模块与 Fok I 酶结合，就完成了 TALENs 的设计。当 Fok I 酶形成二聚体活构时就可以对靶位点进行剪切[9,41]，完成基因组编辑的实验。TALEN 技术原理图如图 2。

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水稻 TGW6 基因编辑检测方法比较研究A 双链的功能，而 II 型 CRISPR/Cas 免疫系统中，只有 1 个 Cas9 蛋白就可以A 双链进行切割[45]。研究发现 CRISPR 系统介导的免疫需要两个 RNA，分别式激活 RNA（trans-activating cr RNA, tracr RNA）和 CRISPR 基因座转录出来-cr RNA。当 tracrRNA 与 pre-cr RNA 互补配对后，激活 RNAase Ⅲ并对 pre-cr R行剪切，使之成为成熟的 cr RNA[46]。成熟的 cr RNA 与 tracr RNA 形成向导 RSingle guide RNA, sg RNA）的嵌合 RNA 分子，sg RNA 引导 Cas9 蛋白在双A 的靶位点上并在原型间隔毗邻序列（Proto-spacer adjacent motif, PAM）的上 bp 的位置切割 DNA 序列[9,47-48]。CRISPR /Cas 9 原理示意图[49]如图 3。

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