基于胞内C-di-GMP操纵的光响应系统及细菌同源重组的定量研究

发布时间：2020-08-29 09:58

　　环鸟苷二磷酸(c-di-GMP)是广泛存在于细菌中一种重要的第二信使分子,在铜绿假单胞菌中,主要参与细菌的运动粘附行为及生物被膜形成的调节。随着合成生物学特别是光响应系统的发展,以环鸟苷二磷酸为对象的相关应用型研究也越来越多。本文的第一部分主要以环鸟苷二磷酸为对象,通过设计构造了单色光响应和双色光响应两套系统,在利用单色光响应系统实现对单细菌的追踪操纵后,通过进一步的优化并建立双色光响应系统,利用静态图案化投影技术,经过对实验体系、实验条件的不断优化测试,最终实现了活细菌生物被膜的可逆定向生物打印。由于工程菌种具有很强的可改造性,光响应系统的建立为研究新型抗菌表面、新型活细菌生物材料及其他应用领域提供了新的方法和思路。而本文的第二部分主要基于三色荧光报告系统设计了一套精准定量细胞内同源重组发生概率的新方法,即三色荧光成像重组率计算系统(Three-color Fluoresencent Proteins based Recombination Rate Calculator System,TFPRRCS),经过聚合酶链式反应(PCR)以及进一步测序的方法验证了该系统的准确性。利用该系统建立的新方法,可以快速准确地定量细胞内同源重组发生的概率,通过对16组重组相关的突变株重组率的定量,发现recA基因的缺失显著降低了铜绿假单胞菌中同源重组发生概率,而uvrD和radA基因的缺失则显著地提升了铜绿假单胞菌中同源重组发生概率,但uvrDrecA和radArecA基因双缺失则将铜绿假单胞菌中同源重组发生概率拉回到较低水平。同时,利用该方法表征了铜绿假单胞菌中不同生理条件下的同源重组发生概率,发现环丙沙星可以显著地提高铜绿假单胞菌内同源发生概率,提高胞内c-di-GMP水平也同样能显著地提高铜绿假单胞菌内同源发生概率。另外,利用该方法探究不同基因组结构对重组率的影响,发现在相同同源臂间距下,同源臂的序列长度越长,重组发生的概率则越高,在一定区间内,同源臂长度和重组率大小成指数关系,但是同源臂长度小于或大于一定数值时这种相关性则消失,通过建模完美地拟合了同源臂长度和重组率大小之间的关系,发现DNA同源重组过程中的链交换过程是由熵驱动的,并且链交换的过程对碱基错配的容忍度很低,而不同同源臂间隔、不同基因组插入位置、不同培养时间以及不同启动子等条件对重组率的影响都没有显著性差异。
【学位单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q93
【部分图文】：

三维结构,二聚体,化学结构,单体

第一章绪论1.1 细菌的第二信使：环鸟苷二磷酸所谓第二信使分子是指细胞内通过信号分子自身浓度的变化来应答胞外信号导影响胞内受体的一类非蛋白类小分子。真核生物中的第二信使包括环腺苷cAMP）、环鸟苷酸（cGMP）、1,2-二酰甘油（DAG）、1,4,5-三磷酸肌醇（IP3）离子等，而原核生物的第二信使包括环腺苷酸（cAMP）、钙离子、环二腺苷c-di-AMP）以及本文的研究对象环鸟苷二磷酸（c-di-GMP）等[1]。环鸟苷二磷两个 GTP 分子经二鸟苷酸环化酶环化而成，如图 1.1 所示[2]，也可被磷酸二酯解成 pGpG 或者分解成 GMP 单核苷酸。研究表明，c-di-GMP 参与调解多种生程，包括细菌的运动黏附行为、生物被膜的形成及其致病性等，其相关研究对被膜的防治和抗生素耐药等[3]问题具有重要意义。

磷酸二酯酶,鸟苷酸环化酶,结构域,新月

般都具有合成 c-di-GMP 的能力，除此之外，部分二鸟苷酸环化酶还具有其他生功能。例如，在新月柄杆菌（C.crescentus）中，二鸟苷酸环化酶还参与到细胞的调控中。新月柄杆菌分裂时，具有 GGDEF 和 EAL 结构域的蛋白被分开至细两极，比如二鸟苷酸环化酶 PleD 则定位至新月柄杆菌的叶柄状一极，合-di-GMP 关闭鞭毛的运动马达、抑制细菌的运动，直至新的基因组复制周期的开1]。磷酸二酯酶可以断裂磷酸二酯键，通常包括磷酸二酯酶 C 和磷酸二酯酶 D、素、鞘磷脂磷酸二酯酶、DNA 酶、RNA 酶和限制性内切酶等，但磷酸二酯酶熟功能还是分解 cAMP、cGMP 和 c-di-GMP 等。磷酸二酯酶通常包含 EAL 或D-GYP 结构域，能够将 c-di-GMP 分解成 pGpG 或者 GMP，例如铜绿假单胞菌包含有 21 个 EAL 结构域蛋白[12]。研究表明，Mg2+和 Mn2+在 c-di-GMP 的分解不可少，Zn2+和 Ca2+则可以抑制该水解过程，而 EAL 结构域中的 Glu 同样对水活性是必须的，因为 E 至 A 的突变是可以使该水解活性失活[13, 14]。

蛋白,结构域,转录调节因子,细菌纤维素

1.1.2 环鸟苷二磷酸的作用机理环鸟苷二磷酸参与调控多种细胞功能，主要通过核糖开关[15]、转录调节因子[16]、包含 PliZ结构域蛋白[17-19]和退化的 GGDEF 或 EAL结构域蛋白[20]等来实现对下游基因的调控。C-di-GMP 参与细胞功能的调控则主要通过与特定蛋白结合的形式来完成对下游基因的调控。例如 c-di-GMP 调节细菌纤维素合成时，能够结合包含 PliZ 结构域的 BcsA 蛋白来激活 BcsA-BcsB 复合体，从而激活细菌纤维素合成酶活性，这表示包含 PliZ 结构域的 c-di-GMP 效应蛋白或者比如新发现的 YajQ 蛋白家族[21]可以作为通用的适配器来连接 c-di-GMP 信号，输入至酶蛋白或者转录因子来开启下游的表达。同时，c-di-GMP 也可以结合众多的转录调节因子，包括响应调节因子或者 Crp家族蛋白等[22]。同样地，c-di-GMP 也能够结合来源于铜绿假单胞菌的 FleQ 蛋白的AAA+ ATP 酶结构域，或者结合组氨酸激酶，如新月柄杆菌中的 CckA 蛋白，来调节下游基因回路[23, 24]。另一方面，c-di-GMP 也可以通过核糖开关来调控下游基因的表达，Sudarsan 等发现在霍乱弧菌等真细菌中，c-di-GMP 可以结合 mRNA 来参与下游

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