拟南芥蛋白激酶调控NADPH氧化酶RBOHF的机理研究

发布时间：2020-09-01 19:06

　　在生物进化的过程中,Ca2+成为真核生物中重要的第二信使之一。在响应生物或非生物胁迫时,细胞质内Ca2+浓度会发生特异的时空变化,这种特异的变化被称之为Ca2+信号。为了响应这些特异的钙信号,植物体内逐步产生了大量的Ca2+感受器和效应器。拟南芥 calcineurin B-like(CBL)和 CBL interacting protein kinase(CIPK)是其中一类典型的Ca2+信号感知和解码蛋白复合物,调控了一系列下游蛋白的应激响应。近些年来,活性氧ROS也被发现是另一类重要的第二信使,尤其在植物免疫反应以及长距离信号转导中有关键作用。最近的研究表明,Ca2+信号通路与ROS信号通路之间存在着某种关联。本研究发现,拟南芥NADPH氧化酶RBOH是Ca2+信号和ROS信号的一个重要结合点。本研究通过生物化学、细胞生物学和遗传学等手段对CBL/CIPK调控RBOHF蛋白活性的分子机理进行了深入研究。本研究发现,在人肾胚(HEK)293T细胞异源表达系统中,CIPK26和CIPK11均能够与CBL1/9 一起激活RBOHF的活性。进一步分析发现,CIPK11和CIPK26对RBOHF的激活不存在协同效应,推测CIPK11和CIPK26可能在不同信号通路中起作用或者二者存在功能冗余。生化结果显示,CIPK11和CIPK26均在体外磷酸化RBOHF-N,而且施加Ca2+能够增强RBOHF-N的磷酸化强度。在HEK293T细胞中进行深入分析发现,RBOHF的激活依赖于CIPK26的激酶活性以及CBL1/CIPK26复合物的细胞膜定位;而RBOHF活性的进一步增强依赖于Ca2+对RBOHF的结合。因此,磷酸化和Ca2+的结合对RBOHF的激活是至关重要的,而且二者似乎能够互相增强彼此的功能。本研究还发现另一个重要的蛋白激酶open stomata 1(OST1/SnRK2.6)也能够在HEK293T细胞中调控RBOHF的活性。在HEK293T细胞中,对OST1的N端增加一个细胞膜定位的信号(PM)后发现,PM-OST1强烈地激活RBOHF。该发现表明OST1在细胞膜上的活性受到如蛋白间互作或者蛋白修饰等未知机制的调控。进一步研究发现,ABA信号通路中的OST1和Ca2+依赖的的CBL1/CIPK26在激活RBOHF上存在协同机制。质谱分析发现,CIPK26和OST1作用于RBOHF-N的位点存在异同。在HEK293T细胞中对这些位点的功能分析使得对RBOHF的调控机制能够进行深入的解析。最后,本研究发现蛋白磷酸酶PP2C家族成员ABI1强烈抑制CBL1/CIPK26和PM-OST1对RBOHF的激活,从而负调控RBOHF的活性。综上所述,我们的研究表明,在拟南芥NADPH氧化酶RBOHF被激活后,其介导的ROS生成能够在很短时间内迅速增强,而RBOHF的激活依赖于蛋白激酶的磷酸化以及Ca2+的结合。同时,我们也发现,RBOHF的活性不仅受到Ca2+依赖的多个蛋白激酶的调控,而且也受到Ca2+不依赖的蛋白激酶调控,从而揭示了 RBOHF调控机制的复杂性。根据本研究的结果,我们对RBOHF的复杂调控机制提出如下的模型:植物体在响应外界胁迫或者发育过程中的刺激信号时,快速形成的特异Ca2+信号能够通过Ca2+结合到RBOHF和Ca2+依赖的磷酸化在数秒或者数分钟内迅速的激活RBOHF;而经过较长时间合成的ABA能够激活OST1,从而增强和维持RBOHF介导的ROS生成。当胁迫或者刺激信号减弱时,ABA浓度的降低使ABI1的活性得到增强,ABI1去磷酸化RBOHF,从而抑制其功能。通过这种方式,RBOHF的磷酸化和去磷酸化得以平衡,使得植物体内ROS的生成得到精细的调控。RBOHF的这些复杂调控机制的生物学意义也会随着研究方法的不断改进而被逐步揭示,而这些机制对于研究其它NADPH氧化酶的调控也有重要的参考价值。
【学位单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q943.2
【部分图文】：

示意图,荧光蛋白,结构示意图,荧光共振能量转移

双荧光蛋白的ＧＥＣＩｓ主要基于荧光共振能量转移技术（ＦＲＥＴ），大多数包含逡逑ＣａＭ－Ｍ１３邋Ｃａ２＋感受域和以三明治结构包夹它们的青色和黄色两种荧光蛋白的变异体逡逑（Ｍｉｙａｗａｋｉ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋１９９７）（图１－１）。当Ｃａ２＋结合到ＣａＭ上之后，该融合蛋白的构象发生逡逑改变，激发光照射后会发生荧光共振能量转移，这种荧光强弱的变化就反映了特异的逡逑Ｃａ２＋信号。随后，Ａｌｌｅｎ等将这种检测Ｃａ２＋的方法运用到了植物中（Ａｌｌｅｎ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋１９９９）。逡逑ＶＦＰ逡逑牛逡逑－Ｃａ２＋逦＋Ｃａ邋２＋逡逑ＣＦＰ逡逑＋邋Ｃａ邋２＋逡逑图１－１双劳光Ｃａ２’指示蛋白Ｃａｍｅｌｅｏｎ结构示意图（Ｍｉｙａｗａｋｉ邋ｅｔａｌ．，１９９７有修改）逡逑示意图展示了两个荧光蛋白如何通过ＦＲＥＴ来检测Ｃａ２＋。在没有Ｃａ２＋时，ＣａＭ和Ｍ１３无法结合，逡逑ＦＲＥＴ不能产生；当Ｃａ２＋结合到ＣａＭ后，Ｃａ２＋－ＣａＭ－Ｍ１３复合物的构象改变，促进ＦＲＥＴ的发生。逡逑３逡逑

示意图,转导,元件,进化过程

结构分析显示，二者具有经典的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶折叠结构，而且主要分为两逡逑瓣，中间由激活环连接，序列分析也发现这些结构在ＣＩＰＫ家族中都很保守逡逑（Ｃｈａｖｅｓ－Ｓａｎｊｕａｎ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２０１４）（图１－４）。单个ＣＢＬ能够与多个ＣＩＰＫ互作来行使功能，而逡逑单个邋ＣＩＰＫ邋也可以和多个邋ＣＢＬ邋互作（Ａｌｂｒｅｃｈｔ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２００１；邋Ｄ’Ａｎｇｅｌｏ邋ｅｔ邋ａｌ．，２００６）。这样逡逑的ＣＢＬ／ＣＩＰＫ互作网络使得在Ｃａ２＋信号转导过程中可以保证有效的信号流通（Ｋｕｄｌａ逡逑ｅｔ邋ａｌ．，２０１０）。逡逑ｎｎ逡逑逦邋？0逡逑逦逦＇Ｖ逡逑ｍ「Ｉ邋赢邋知逡逑Ｅｕｄｉｃｏｔｙｌｅｄｏｎｓ逡逑Ｍｏｎｏｃｏｔｙｌｅｄｏｎｓ邋Ｉ逡逑／逦＾逦一’ｔ二邋Ｇｙｍｎｏｓｐｅｒｍ逦ｉ逦／逡逑ｖｊｆ邋ＬＬＪ邋ｐｔｅｒｉ７＾ａ邋．邋ｙ逡逑Ｃｈａｒｏｐｈｙｔａ邋ｉｌｌ／逡逑Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ邋＼逦１逦Ｊ逦／逡逑ｊＶＤＣＣ逡逑ｊＰ２Ｘ邋ＲｔＣｙｓ－ｌｏｏｐ＊邋ＣＣａＭＫ逡逑／？ＳＴＩＭ邋ＣＢＬ邋１逦３逦５逦４逦７逦１１逦１０逡逑／逦ＣＩＰＫ邋１逦１逦７逦５逦２６逦３４逦２６逡逑１逦ＣＤＰＫ３逦１２逦２５逦１０逦１３逦３１逦３４逡逑Ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ邋ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ逦．邋Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ邋ａｂｕｎｄａｎｃｅ逡逑图１－３植物Ｃａ２＋信号转导元件的进化示意图（Ｅｄｅｌｅｔａｌ．，２０１７）逡逑植物在从水生到陆生的进化过程中，Ｃａ２＋信号元件在各自的进化位置出现显著减少（红色箭头）逡逑和增加（绿色箭头）。蓝色代表海洋

离子转运,复合物,拟南芥,离子通道

１．２．３邋ＣＢＬ／ＣＩＰＫ调控网络的功能和机理逡逑近些年来越来越多的ＣＢＬ／ＣＩＰＫ复合物被报道参与了离子转运、非生物胁迫响应、逡逑植物发育和免疫反应等过程（图１－５）。ＣＢＬ／ＣＩＰＫ复合物对底物的调控主要是在细胞逡逑膜上，而定位于液泡膜的ＣＢＬ／ＣＩＰＫ复合物的功能还不是很清楚，但是定位于液泡膜逡逑的ＣＢＬｓ在调控液泡ｐＨ、Ｋ＋动态平衡和ＡＢＡ信号转导等方面均有报道（Ｂａｔｉｓｔｉｃ邋ｅｔ邋ａｌ．，逡逑２０１２；邋Ｌｉｕ邋ｅｔ邋ａｌ．，２０１３；邋Ｔａｎｇ邋ｅｔ邋ａｌ．，２０１２）。ＣＢＬ２蛋白的Ｎ端经过硫酰化修饰后使其定位逡逑于液泡膜上，Ｍ／２突变体不能对ＡＢＡ做出正常响应，主要表现为在添加有ＡＢＡ的培逡逑养基上，ｃＷ２突变体不能正常萌发（Ｂａｔｉｓｔｉｃ邋ｅｔ邋ａｌ．，２０１２）。然而，拟南芥的ＣＢＬ２如何通逡逑过液泡内的Ｃａ２＋信号调控ＡＢＡ响应的依然不清楚。虽然ＣＢＬ２和ＣＢＬ３的蛋白序列逡逑有９２％的相似性，但是只有ｃＷ２单突变体表现出ＡＢＡ超敏感的表型，表明ＣＢＬ２和逡逑ＣＢＬ３的功能在调控ＡＢＡ响应过程中并不冗余。另有文献报道，在低Ｋ＋胁迫下ＣＢＬ３逡逑与ＣＩＰＫ９参与到调控Ｋ＋动态平衡中

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