阿魏酸己酯对单增李斯特菌的抑菌活性及亚细胞机理研究

发布时间：2020-09-02 08:28

　　 阿魏酸(FA)是一种可再生的酚类芳香化合物,广泛存在于当归、阿魏、升麻等中草药中。FA分子中的酚羟基和C=C结构使其具有普遍的生物活性和药理作用,可用于抗血栓、抗衰老、抗肿瘤、提高人体免疫力等方面,但其烷烃基较短,脂溶性不佳,难以透过生物膜中的脂溶性双分子层,限制了其生物活性和复杂食品体系中的应用。因此本文为了提高阿魏酸的亲脂性,通过化学法和生物法,利用脂肪醇对FA进行共价修饰,提高其亲脂性及生物活性,拓宽其在食品体系中的应用范围,特别是富含油脂类的食品体系中。首先,采用化学法(Knoevenagel法)和生物法(脂肪酶催化法),制备了阿魏酸己酯(FAC6),并通过硅胶柱色谱分离法对FAC6进行分离纯化,再结合核磁共振(1H-NMR、13C-NMR)、二级质谱(MS2)与红外光谱(IR)技术对FAC6进行结构表征与鉴定。其次,研究了 FAC6对常见食源性致病菌单增李斯特菌(L.monocytogenes)的抑菌活性。FAC6对L.monocytogenes 的 MIC 值为0.1mM,MBC值为0.4mM;通过FAC6对L.monocytoge es的时间-杀灭动力曲线与生长曲线测定分析,发现FAC6的抑制作用具有浓度和时间依赖性,且随着时间的延长,L.monocytogenes的自溶活性逐渐增强。进一步对FAC6对L.monocytogenes抑菌的亚细胞机理进行了探讨,即通过FAC6对L.monocytogenes细胞膜的影响、膜蛋白的影响、与DAN的相互作用三个方面进行了研究。对细胞膜的影响,PI摄取量和胞内大分子蛋白质、核酸的泄漏量实验结果表明,FAC6显著改变了L.monocytogenes细胞膜的完整性和通透性;FAC6预处理使细胞膜表面ζ-电位表现出超极化现象;通过扫描电子显微镜(SEM)观察发现FAC6作用后的L.monocytogenes细胞壁局部消失、细胞膜表面形成孔洞,细胞裂解;观察透射电子显微镜(TEM)图可发现FAC6作用后的细胞表面出现破裂,细胞内部细胞质流失。以上系列结果说明,表明FAC6使L.monocytogenes的细胞膜受到了损伤。对蛋白质的影响,FAC6与L.monocytogenes膜蛋白作用6 h后,在SDS-PAGE电泳图中发现其蛋白条带出现颜色变浅、加深、甚至部分条带消失以及新条带生成的现象,表明FAC6对膜蛋白的成份产生了影响;在荧光光谱分析中发现FAC6对细胞膜表面的苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)残基具有猝灭作用,并伴随红移现象,说明FAC6使氨基酸残基的微环境更加亲水,改变了膜蛋白的构象。在DNA分子水平上,FAC6与基因组DNA相互作用(采用紫外-可见吸收光谱法、荧光光谱分析、熔点(Tm)值和分子对接(molecular docking))的研究结果表明FAC6与DNA是通过凹槽模式结合作用的。最后,测定了 0.1 mM FAC6在鲟鱼鱼子酱贮藏过程中对接种L.monocytogenes菌落总数的影响,结果表明FAC6能显著抑制贮藏过程中鳄鱼鱼子酱中L.monocytogenes的生长,延长鱼子酱的货架储存期。
【学位单位】：浙江工商大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：TS201.3
【部分图文】：

图１－３研究路线逡逑Ｆｉｇ．邋１－３邋Ｒｅｓｅａｒｃｈ邋ｒｏｕｔｅ逡逑

ＴＬＣ分离纯化的重点在于配制合适比例的展开剂，通过文献报道和预实验逡逑的摸索，展开剂的配比确定为ＰＥ／ＥＡ＝４：１邋（Ｖ／Ｖ）。ＦＡＣ６的薄层色谱分离结果如逡逑图２－４所示。其中图（Ａ）为磷钼酸显色，Ｌｉｎｅ邋１是丙二酸半酯的粗产物点样，Ｌｉｎｅ逡逑２是丙二酸半酯粗产物与己醇点样的交叉点，Ｌｉｎｅ邋３是己醇点样，图中Ｌｉｎｅ邋１箭逡逑头指示的目标产物丙二酸半酯上方并未出现己醇的点，表示己醇己完全反应。图逡逑（Ｂ）为碘显色，Ｌｉｎｅ邋１是ＦＡＣ６的粗产物点样，Ｌｉｎｅ邋２是ＦＡＣ６的粗产物与反应物逡逑香草醛的交叉点样，Ｌｉｎｅ３是反应物香草醛点样，从图中Ｌｉｎｅ邋１可知，箭头指示逡逑的目标产物ＦＡＣ６下方还有微量香草醛未反应完。并且在Ｌｉｎｅ邋１邋ＦＡＣ６点的上方逡逑应该是两个杂质点，一个是图中明显观察到的杂质点（靠近硅胶板上方边缘），逡逑另一个是紧邻着ＦＡＣ６上方的杂质点，由于ＦＡＣ６产率高，ＦＡＣ６的点浓且大，逡逑而紧邻的杂质点浓度非常的低，通过碘显色，基本观察不到。考虑到其他杂质点逡逑与ＦＡＥｓ在此展开剂条件下分离效果明显

ＴＬＣ分离纯化的重点在于配制合适比例的展开剂，通过文献报道和预实验逡逑的摸索，展开剂的配比确定为ＰＥ／ＥＡ＝４：１邋（Ｖ／Ｖ）。ＦＡＣ６的薄层色谱分离结果如逡逑图２－４所示。其中图（Ａ）为磷钼酸显色，Ｌｉｎｅ邋１是丙二酸半酯的粗产物点样，Ｌｉｎｅ逡逑２是丙二酸半酯粗产物与己醇点样的交叉点，Ｌｉｎｅ邋３是己醇点样，图中Ｌｉｎｅ邋１箭逡逑头指示的目标产物丙二酸半酯上方并未出现己醇的点，表示己醇己完全反应。图逡逑（Ｂ）为碘显色，Ｌｉｎｅ邋１是ＦＡＣ６的粗产物点样，Ｌｉｎｅ邋２是ＦＡＣ６的粗产物与反应物逡逑香草醛的交叉点样，Ｌｉｎｅ３是反应物香草醛点样，从图中Ｌｉｎｅ邋１可知，箭头指示逡逑的目标产物ＦＡＣ６下方还有微量香草醛未反应完。并且在Ｌｉｎｅ邋１邋ＦＡＣ６点的上方逡逑应该是两个杂质点，一个是图中明显观察到的杂质点（靠近硅胶板上方边缘），逡逑另一个是紧邻着ＦＡＣ６上方的杂质点，由于ＦＡＣ６产率高，ＦＡＣ６的点浓且大，逡逑而紧邻的杂质点浓度非常的低，通过碘显色，基本观察不到。考虑到其他杂质点逡逑与ＦＡＥｓ在此展开剂条件下分离效果明显

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本文编号：2810368