“下丘脑—脑干—肠脑轴”中CRF在大鼠束缚—浸水应激中的作用

发布时间：2020-09-02 12:28

　　束缚-浸水应激模型(Restraint Water-Immersion Stress,RWIS)是一种快速对大鼠心理和生理造成伤害的刺激模型。在这种应激模型中,大鼠在短时间内因受到刺激,体温下降,胃肠功能紊乱,导致胃酸分泌增加和急性胃黏膜损伤。肠神经系统是位于胃肠道壁中的神经元、神经递质和肠细胞组成的网络,控制和调节胃肠道中的平滑肌,黏膜上皮和血管效应系统,它的调节具有高度的自主性,因此也被称为“肠脑”。经本实验室的早期研究发现,大鼠在一定的应激时间段内,随着束缚-浸水的时间增长,下丘脑的室旁核(hypothalamic paraventricular nucleus,PVN)、视上核(supraoptic nucleus,SON)、孤束核(Solitary Nucleus,NTS)、迷走神经背核(dorsal motor nucleus of the vagus,DMV)和肠道肌间神经丛中Fos和GFAP(Glial Fibrillary Acidic Protein,GFAP)的表达水平显著升高,我们推测束缚-浸水应激造成胃黏膜损伤不只是涉及到脑干内神经元的过度活动这种初级中枢机制~([75]),所以我们提出了“下丘脑-脑干-肠脑轴”环路参与了对应激的调控。而促肾上腺皮质激素释放激素(Corticotropin-Releasing Factor,CRF)作为下丘脑的室旁核、视上核释放的非常重要的激素之一,已研究表明其参与了多种应激(热刺激、冷刺激、感染和毒物刺激)反应,但促肾上腺皮质激素释放激素(CRF)及其受体是否参与了束缚-浸水应激尚未见报道。因此,我们提出以下几个问题:1.CRF及其受体是否介导和参与了RWIS过程,并在RWIS中各时间段有何变化?2.侧脑室注射CRF受体阻断剂Astressin和CRF后,对孤束核及肠道内的神经元和胶质细胞有何影响?3.CRF若参与束缚-浸水的过程,是通过哪条信号路径起作用?为了解决上述问题,我们实验设计如下:实验研究一:大鼠随机分为对照组(RWIS 0h)和应激组(RWIS 1h,RWIS 2h,RWIS3h)后,采用免疫组化和免疫印迹法检测大鼠CRF及其受体表达的影响,以探讨CRF及其受体是否参与了RWIS过程。实验研究二:将大鼠分为对照组(侧脑室注射生理盐水)、CRF组(侧脑室注射CRF)和Astressin组(侧脑室注射CRF-R抑制剂Astressin),大鼠束缚-浸水应激1h后,免疫组化和免疫印迹法检测NTS、DMV以及肠神经系统中Fos、GFAP、p-ERK1/2、NOS表达,探讨CRF在束缚浸水过程中的作用?实验研究三:将大鼠分为对照组(侧脑室注射生理盐水)、CRF组(侧脑室注射CRF)和PD98059+CRF组(侧脑室注射p-ERK1/2特异性抑制剂PD98059和CRF),大鼠束缚-浸水应激1h后,免疫组化和免疫印迹法检测NTS和DMV内Fos和星形胶质细胞的标记物GFAP表达的变化,探究CRF参与束缚-浸水的信号途径?实验研究四:将大鼠分为对照组(侧脑室注射生理盐水)、CRF组和Astressin组,大鼠束缚-浸水应激1h后,免疫组化和免疫印迹法检测肠神经系统中的Claudin-1、Occludin和胃黏膜中的MUC5AC表达变化,探究CRF对胃肠道功能的影响?实验结果:1.与对照组相比,实验组大鼠脑干迷走复合体内CRF-R1与肠神经系统内CRF的表达明显增加,且呈时间依赖性,在3h达到了最高。而与对照组相比,实验组大鼠迷走复合体内CRF-R2的表达明显降低,且呈时间依赖性,在3h达到了最低。表明肠神经系统内CRF及脑干(NTS、DMV)内CRF-R1被激活,参与了RWIS过程。2.与侧脑室注射生理盐水对照组相比,侧脑室注射CRF-R抑制剂Astressin,束缚-浸水应激1h后,实验组NTS、DMV以及肠神经系统中的Fos表达、星形胶质细胞GFAP、p-ERK1/2、NOS表达都显著降低。而侧脑室注射CRF,束缚-浸水应激1h后,实验组NTS、DMV以及肠神经系统中的Fos表达、星形胶质细胞GFAP、p-ERK1/2、NOS表达都显著升高,表明促肾上腺激素释放激素可能激活了脑干和肠神经系统内一氧化氮能神经元参与了在束缚-浸水应激过程。3.与侧脑室注射CRF对照组相比,侧脑室注射p-ERK1/2特异性抑制剂PD98059和CRF后,实验组NTS、DMV以及肠神经系统中的Fos和星形胶质细胞的标记物GFAP表达明显下降,表明CRF可能通过ERK1/2信号通路参与束缚-浸水过程。4.与侧脑室注射生理盐水对照组相比,侧脑室注射CRF组肠神经系统中的Claudin-1、Occludin和胃黏膜中的MUC5AC表达显著降低。表明束缚-浸水对大鼠造成胃机能的损伤和机体内部发生了紊乱,而CRF在这个过程中可能加速了炎症反应和胃溃疡,而且这个过程主要是通过ERK1/2信号通路进行调控的。实验结论如下:1、脑干内的CRF受体CRF-R和结肠内的CRF都参与了束缚浸水应激的过程。2、CRF主要是通过ERK1/2信号通路对束缚浸水后造成的胃肠机能紊乱进行调控的。
【学位单位】：山东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q42
【部分图文】：

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图 1 下丘脑和脑干对胃机能的调控示意图[121]CRF 及其受体 CRF 及其受体的结构、分布与功能特征促肾上腺皮质激素释放因子（Corticotropin-Releasing Factor，CRF ；在啮齿类中称orticotropin-Releasing Hormone，CRH）是由 41 个氨基酸组成的神经肽，它是作为重要的神经内分泌肽在下丘脑中第一个被提取到的。分泌 CRF 的神经元主要位于脑的室旁核（PVN）、视上核（SON），但在海马、杏仁核、纹状体、蓝斑和背缝脑区也有 CRF 的分布，经实验证明这些部位与情绪情感有关[9]。CRF 和 CRF 相关肽发挥其生物学作用是通过与受体（CRF-R）结合起作用的。普为其受体分为两种，即 CRF-R1（Corticotropin-Releasing Factor type 1）、CRF-R2orticotropin-Releasing Factor receptor type2）。这两种受体都是属于 II 型 G 蛋白偶联

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图 2 MAPK 信号传导途径，由 ERK，JNK，p-38 和 ERK5 组成，其中每一种主要包括MKKK，MKK 和 MAPK 三级蛋白激酶。5.2 ERK 家族成员胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）是 MAPK 家族的一个非常重要的一员，它的信号传递途径是涉及调节细胞生长、发育及分裂的信号网络的核心。现在已知 ERK 家族有 5 个亚族，包括 ERK1、ERK2、ERK3、ERK4、ERK5。而分子量为 44kD 和 45kD 的 ERK1 和 ERK2 途径是现在 ERK 家族中被研究最深入的，它们表达广泛，涉及调节在不同细胞内的重要生理活动，比如减数分裂、有丝分裂等一系列生理过程[51-53]。而当机体受到超过自身承受范围的应激时会导致 ERK1/2 信号通路的激活。5.3 ERK1/2 信号通路在应激反应中的调控

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山东师范大学硕士学位论文动物山东大学动物中心，Wistar 雄性大鼠，体重 230g 。饲养 3 天左右（适应环境后进行如下实验。-浸水应激模型的建立前一天，对大鼠禁食但可以使其自由饮水。束缚-浸水模型的制备：），用异氟烷轻微麻醉大鼠，迅速用医用胶带将大鼠四肢固定于自制木固定大鼠的牙齿，防止清醒后头部扭动。待大鼠清醒后将其放到冷水剑突与水位持平，见图（1-1），对大鼠进行束缚-浸水应激。为了避激反应的影响，因此将大鼠的 RWIS 时间选在上午进行。

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