笔筒树性别分化与DNA甲基化关系的研究

发布时间：2020-09-04 20:43

　　笔筒树(Sphaeropteris lepifera(Hook.)R.M.Tryon)属于侏罗纪孑遗的唯一树状蕨(Tree ferns)桫椤科(Cytheaceae)植物,其在植物系统演化中扮演着独特的角色。而近年来,笔筒树野生种群生长环境受到破坏,幼苗又出现数量减少、成活率低等问题,因此研究笔筒树生殖机制对解决其生殖障碍具有重要的意义。DNA甲基化作为表观遗传学的重要组成部分,其在植物整个生长发育的过程中都发挥着关键作用。目前,对于DNA甲基化模式是否能够稳定遗传,是否在性别分化中作为诱导因子作用,尚没有统一观点。但是植物在生殖过程中,许多基因的表达都是通过去甲基化完成的,可见DNA甲基化对植物生长发育至关重要。S-腺苷甲硫氨酸(SAM)作为DNA甲基化的甲基供体,对植物的生长发育和抵抗逆境胁迫有重要作用。5-氮杂胞嘧啶核苷(5-azaC)能够通过嵌入DNA与甲基转移酶结合,从而抑制甲基化状态的维持。因此,我们采用这两种化学物质来处理笔筒树的配子体,以期探究DNA甲基化与笔筒树性别分化的关系。结果如下:(1)使用5-azaC和SAM处理了笔筒树配子体,通过统计其成苗率、雌雄配子体比率和配子体精子器颈卵器的数目发现:5-azaC对笔筒树成苗率的影响不大,SAM处理笔筒树的成苗率升高;5-azaC促进雄配子体的分化,在浓度100μM时表现得尤为明显;SAM能够促进雌雄配子体的分化,而且降低了无性配子体(未分化)的比率,在一定程度上可以说明SAM能够促进笔筒树配子体的提前发育。5-azaC能大幅度促进雄配子体的发育,包括精子器数目增多、精子器分布区域扩大等。(2)使用LC-MS/MS方法测定了5-azaC和SAM处理笔筒树配子体的总胞嘧啶甲基化率。结果表明,5-azaC能够提高笔筒树配子体的甲基化率,在3h、24h、48h、96h分别达到了约18.80%、18.04%、23.10%、29.45%。SAM处理笔筒树配子体,其甲基化率呈先升高后降低的趋势,在3h、24h、48h、96h分别达到了约11.80%、5.06%、4.82%、4.92%。(3)使用MSAP方法分析了5-azaC和SAM处理的笔筒树配子体DNA CCGG甲基化的变化。结果表明:64对引物组合共扩增出多态性条带2411条,其中总甲基化条带数在940~1166之间,对照组笔筒树DNA CCGG点位的总甲基化率为38.99%,全甲基化率为16.76%,半甲基化率为22.23%,单链DNA外部甲基化、DNA双链内部甲基化和双链DNA外部甲基化分别占18.08%、24.89%和57%;5-azaC处理能够提高笔筒树DNA CCGG点位的总甲基化率(42.51%),降低全甲基化率(16.26%),提高半甲基化率(26.26%),甲基化多态性比率是84.25%,去甲基化所占比重大(52.91%),超甲基化所占比重小(31.34%);SAM处理能够提高笔筒树DNA CCGG点位的总甲基化率(48.36%),提高全甲基化率(31.36%),降低半甲基化率(19.33%),甲基化多态性比率为73.53%,去甲基化所占比重小(33.21%),超甲基化所占比重大(40.32%)。
【学位单位】：哈尔滨师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q943
【部分图文】：

成苗率,雄配子体,雌配子体,比率

图 2-1 不同处理下笔筒树的成苗率注：不同字母代表其在统计学上有显著差异（p<0.05）Fig.2-1The seeding rate of Sphaeropteris lepifera under different treamentsNote: different letters mean statistically significant difference(p<0.05).2 笔筒树雌雄配子体比率统计从图 2-2 可以看出，经过 5-azaC 和 SAM 处理后的笔筒树的雌、雄配子体现了较大的差别，总的来说 5-azaC 处理的是促进雄配子体的分化，SAM 促进雌配子体的分化。两者处理笔筒树，雄配子体的分化都多于对照组为 100μM 的 5-azaC 处理下的笔筒树表现得非常明显，高达 48.3％，10μ的雄配子体比率也要高于其他处理和对照，达到了 39.3%。SAM 处理下配子体比率也要高于对照组，但没有达到 5-azaC 处理下的雄配子体的程M 和 100μM SAM 处理的雄配子体比率分别达到 25.9%和 24.4%。在 5-azaC 处理下的笔筒树雄配子体的分化与雌配子体的差别非常明显，的分化高于雌配子体的分化，在浓度为 10μM 处理时的雄配子体比雌配化高出 4 倍；浓度为 100μM 时雌配子体的分化还不到 4%，但是雄配子

树性,比率,精子器,雄配子体

图 2-2 不同处理下笔筒树性别分化比率注：不同字母代表其在统计学上有显著差异（p<0.05）Fig.2-2 The sex differentiation rate of Sphaeropteris lepifera under different treatmentsNote: different letters mean statistically significant difference(p<0.05)2.3.3 笔筒树性器数目统计如图 2-3，在 5-azaC 处理下，雄配子体中精子器的数目要远远高于 SAM 处理和对照组。10μM 处理下笔筒树雄配子体中精子器的平均数目达到了 162.7；100μM处理下笔筒树雄配子体中精子器的平均数目则达到了 124.3。而 5-azaC 处理下雌配子体中颈卵器的数目与对照组没有差别。在 SAM 处理下，笔筒树雄配子体中精子器的数目均与对照组没有明显差异；雌配子体中颈卵器的数目略高于对照组和5-azaC 处理组。

精子器,雄配子体,数目,颈卵器

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