本氏烟ataxin-3抑制表达的生理表型和蛋白质组学研究

发布时间：2020-09-04 20:48

　　 本实验室前期以缺水处理的马铃薯(Solanum tuberosum L.)叶片为材料,构建了转录子消减cDNA文库,文库筛选及表达分析,识别了马铃薯缺水响应基因StATX-3,并克隆了其全长cDNA。检索马铃薯基因组数据库发现,StATX-3位于第10号染色体,依据其序列相似性,注释StATX-3为马铃薯ataxin-3(DMP400033234)。检索文献数据库,未见植物ataxin-3功能的研究报道,故其在缺水胁迫中的作用有待证明。基于此,本研究拟通过亚克隆,构建反义StATX-3cDNA表达载体,转化反义StATX-3cDNA于本氏烟体内表达,筛选抑制本氏烟ataxin-3表达的转化株系,测定和分析其生理表型和蛋白组表达谱变化,确定StATX-3参与的代谢途径。研究结果如下:(1)利用pC-35S和pG-StATX-3载体,亚克隆构建了反义StATX-3 cDNA重组载体pC-35S-StATX-3。通过农杆菌遗传转化途径,将目的重组基因转入本氏烟(Nicotianatabacum L.)体内,依据同源基因mRNA和ataxin-3积累测定结果,筛选获得了 ataxin-3积累极显著减少(p0.01)的转化株系stax-1和stax-7。(2)叶片生理表型测定结果显示,stax-1和stax-7两株系ATP含量显著高于野生型对照(p0.05),表明抑制本氏烟ataxin-3表达,提高了 ATP积累。同时,stax-1和stax-7叶片叶绿素含量极显著高于对照(p0.01),表明抑制本氏烟ataxin-3表达,促进叶绿素积累。(3)根据两个阳性株系叶片同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)分析结果,识别了168个表达量倍数变化的差异丰度蛋白(Differential abundance protein species,DAPs)。通过GO功能分类和KEGG途径富集分析,确定了这些DAPs主要参与氧化磷酸化和萜类代谢等途径。其中,发现两个光合磷酸化ATP合成酶ATPF和ATPE表达倍数极显著增加(p0.01),表明抑制本氏烟ataxin-3表达,可提高光合磷酸化ATP合成。此外,抑制本氏烟ataxin-3表达,叶绿素合成相关酶表达倍数也显著高于对照。生理表型和蛋白质组测定分析结果表明,抑制本氏烟ataxin-3表达,增强了光合磷酸化ATP合成和萜类积累。结合能荷调控缺水响应的研究报道,推测StATX-3通过参与能荷调控响应缺水胁迫。
【学位单位】：宁夏大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q943.2
【部分图文】：

图１－２技术路线示意图逡逑

图２－１逦基因ＵＮＡ特异引物菌落１＞ＣＲｒｋｅｒ逦２－４，ｐＣ－３５Ｓ－６７．－１７；Ｖ－３邋ｆｉｆｅＦＣＲ切鉴定逡逑体ｐＣ－３５Ｓ－＞Ｓ’ＭＬＹ－３正确构建，将上述２．３．１邋（１）质粒，利用限制性内切酶和及Ｗ７／／Ｉ对ｐＣ－

ＤＬ２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ：泳道邋１－２，邋ｐＣ－３５Ｓ－ｉ’ＨｒＸ－３邋重组载体双酶切产物；泳道邋３，ｐＣ－ＤＬ１５０００ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ）逡逑２．３．２阳性重组农杆菌筛选逡逑按照本章２．２．２描述的方法，转化重组载体ｐＣ－３５Ｓ－＆４７Ｘ－３于根癌农杆板上挑选单菌落，用说４：／义－３特异引物ＡＸＦ和ＡＸＲ进行菌落ＰＣＲ，产物用胶电泳检测，结果如图２－３所示，菌落ＰＣＲ获得了逦基因ＤＮＡ片段，预期的８５５ｂｐ—致，表明研究获得了阳性重组根癌农杆菌ｐＣ－３５Ｓ－？ＪＬ￥－３；保存，用于其后侵染外植体，转化反义泣于本氏烟。逡逑２０００邋——Ｉ逡逑１０００邋—■逡逑７５０邋—■逡逑５００邋—■逡逑２５０邋—■逡逑１００邋—■逡逑图２－３重组农杆菌菌落ＰＣＲ产物电泳结果逡逑

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本文编号：2812570