杆状病毒VLF-1功能域的研究及其互作蛋白的筛选

发布时间：2020-09-05 06:57

　　 vlf-1是杆状病毒AcMNPV的核心基因之一,也是病毒感染的必需基因,其同源序列存在于所有已测序的杆状病毒中。最初的研究发现该基因编码的蛋白影响极晚期基因的超表达,因此命名为极晚期表达因子1(very late expression factor 1,VLF-1)。后来研究发现VLF-1对病毒核衣壳形成是必需的,该基因缺失突变病毒能观察到空管状衣壳鞘结构,表明VLF-1参与了病毒核衣壳的组装。vlf-1突变病毒的基因组DNA能被DNA酶完全降解,而其他某些病毒基因缺失也产生空管状衣壳鞘的病毒,其病毒基因组DNA有大约35%被保护而不被DNA酶降解,这表明VLF-1可能参与调控病毒基因组DNA的包裹。另外,VLF-1作为核衣壳结构蛋白,定位于核衣壳的末端。因此,VLF-1在病毒DNA加工、包裹和核衣壳组装的最后阶段有关键作用。本实验从两个方面对VLF-1的功能进行更深一步的研究。一、通过对VLF-1蛋白结构的预测,依据保守型结构域、整合酶家族结构域、DNA断裂-再连接酶结构域以及蛋白、DNA、RNA结合位点对vlf-1基因序列进行针对性的截短,在Bac-to-Bac系统中构建了十二个截短型和拯救型重组杆状病毒质粒并转染Sf9细胞,使用光学显微镜、荧光显微镜观察重组病毒在细胞中的复制情况,分析截短型VLF-1对病毒复制的影响。二、通过酵母双杂交的手段,构建AcMNPV感染的Sf9细胞总cDNA文库,利用结合法筛选,再利用缺陷型培养基逐步验证与VLF-1互作的蛋白。在得出初步结果后利用CO-IP、双分子荧光互补等技术,进一步验证互作蛋白。最后通过亚细胞定位等方式来探究其在细胞中互作的位置。以此来探究VLF-1调控病毒核衣壳组装及极晚期转录的机制。实验结果表明,在一系列截短型重组病毒中,碱基序列为1-1044 bp的截短型在Sf9细胞中的复制和感染情况与野生型和拯救型类似,说明其关键功能域存在于该区域。而在互作蛋白的筛选中,初步筛选出19种可能与VLF-1互作的蛋白,并挑选出以下由AcMNPV编码的蛋白:39K(Ac36)、VLF-1(Ac77)、CG30(Ac88)、VP39(Ac89)、LEF-5(Ac99)、P6.9(Ac100)、ME53(Ac139),进行深入验证。验证结果表明 39K(Ac36)、CG30(Ac88)、LEF-5(Ac99)与VLF-1存在互作。亚细胞共定位实验表明,39K与VLF-1共定位于细胞核。亚细胞定位实验表明,39K定位于细胞核;CG30定位于细胞核膜;LEF-5定位于细胞核。其中,39K是一个能与单链和双链DNA结合的蛋白;CG30含有一个锌指和亮氨酸指的结构,删除该蛋白后病毒的滴度急剧下降;LEF-5是一个晚期表达因子,含有一个类似于RNA聚合酶II延伸因子(TFIIS)的结构域,主要功能是调节晚期基因转录。我们推测VLF-1可能通过与39K相互作用参与病毒DNA的加工;通过与CG30的互作参与核衣壳的组装;通过与LEF-5的互作调控极晚期基因的超表达。其具体的作用机制仍有待阐明。
【学位单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q78
【部分图文】：

其膜融合蛋白为Ｆ蛋白［ｉｙ。另外，根据杆状病毒包埋型病毒（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ邋ｖｉｒｕｓ，逡逑ＯＤＶ）粒子囊膜包裹的核衣壳数，ＮＰＶ可被分为多粒包埋型（ＭＮＰＶ）和单粒包埋型（ＳＮＰＶ）逡逑（图１－１）；邋ＧＶ同样也存在单粒和多粒包埋型，但是多粒包埋型相当稀少。多粒包埋和逡逑单粒包埋只是形态的区别，并不是分类的依据。逡逑

ＡｃＭＮＰＶ作为模式种，其基因组于１９９４年第一个被测出。测序结果表明，其基因组逡逑大小为１３３．９８４邋ｋｂ，编码序列达９１邋％，有１５４个ＯＲＦ［２７］，其中的２９个基因是核心基因，逡逑是病毒复制、转录、组装所必需的。ＡｃＭＮＰＶ基因组物理图谱如图１－４所示。逡逑

图１４ＡｃＭＮＰＶ基因组物理图谱逡逑Ｆｉｇ．邋１－４邋Ｇｅｎｏｍｅ邋ｐｈｙｓｉｃａｌ邋ｍａｐ邋ｏｆ邋ＡｃＭＮＰＶ逡逑基因逡逑病毒基因同源性分析，发现在己测序的所有杆状病毒中均存在一些共有的因，称为核心基因。核心基因对于病毒ＤＮＡ复制、基因转录和翻译、核增殖的必需步骤至关重要。目前已发现３０个核心基因【２８－３％分别为：与病毒基因，如＜２Ｃ（５５，ａｃ９５，／￥？／，与基因转录翻译相关基因，如／？４７，／８，Ｉｅｆ－９；与病毒组装相关基因，如邋ｐ６．９，邋ｖｐ３９，邋ｖ！ｆ－Ｊ，邋ｄｅｓｍｏｐ，邋ｏｄｖ－ｅ２７，邋ａ！ｋ－６１，ｐ９５，ｖｐｌ０５４，ｇｐ４０，３８ｋ，ａｃｌ０９，ａｃｌ０３，ａｃ９２，ｏｄｖ－ｅ２５，ｏｄｖ－ｅＩ９，ａ毒感染相关基因，如／？７４。这些生命周期中起着关键性的作用［３１］。逡逑表达的时序性逡逑病毒基因在宿主细胞内的表达具有明显的时序性，依据表达时间可将病毒

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本文编号：2812706