酵母细胞壁提取物干预DON诱导猪肠上皮细胞氧化损伤及机理
发布时间：2020-09-05 09:43
脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)又名呕吐毒素(vomitoxin,VT),是一种污染谷物严重且广泛存在的单端孢菌霉菌毒素,主要是镰刀菌属产生的有毒次级代谢产物,对人类和动物产生复杂的毒性作用。研究表明DON诱导由ROS介导的氧化应激被认为是导致细胞死亡和凋亡的机制之一。酵母细胞壁提取物(Yeast cell wall extract,YCWE)由葡聚糖、甘露聚糖和糖蛋白组成,是一类抗氧化、抗炎、增强免疫、促生长和改善动物肠道环境的天然物质。目前,YCWE用于禽畜养殖业研究较多,但在毒素干预方面尚未有深入研究。本实验以猪肠上皮细胞(1PEC-J2)为细胞模型,探究DON对IPEC-J2细胞的毒性机制及YCWE对细胞的保护效应的机制。1.DON的细胞毒性及YCWE对其毒性干预的研究:以IPEC-J2细胞为研究对象,构建肠上皮细胞损伤模型,研究DON的毒性效应;同时探究YCWE对低浓度DON(1 μmol/L)细胞毒性的干预作用。从DON和YCWE对细胞活性、细胞形态、抗氧化及抗炎效果给予评价。结果如下:1)MTS测肠上皮细胞活性方面:DON以剂量和时间依赖性方式使细胞活性显著降低;而加入YCWE作用12-36h后DON的细胞毒性降低。2)倒置显微镜观察细胞形态方面:1 μmol/L DON作用不同时间后细胞形态被破坏,36 h后出现漂浮和贴壁不紧的细胞,而YCWE与DON共同处理细胞12、24和36 h后,YCWE明显抑制DON对1PEC-J2细胞形态的损伤,维持细胞的正常形态。3)ELISA法检测细胞培养液中炎性因子方面:1 μmol/L DON处理细胞12 h和24 h后,炎性因子IL-6、IL-8、IL-1p和TNF-α均呈现增加的趋势。与DON组相比,添加YCWE后各炎性因子的含量发生不同程度的变化。4)氧化指标方面:1 μmol/L DON处理细胞12 h和24 h后,显著增加MDA和ROS的水平,降低GSH的含量。同样激光共聚焦显微镜分析显示,DON处理细胞24 h后,细胞内ROS含量也呈现显著增加的趋势,CPDT和YCWE均能够显著抑制ROS的生成。用YCWE处理被DON损伤的IPEC-J2细胞,胞内的MDA和ROS含量下调,GSH上调。以上结果表明,1μmol/L DON显著降低细胞活性,形态被破坏,诱导氧化应激和炎症的发生;YCWE逆转了此浓度下DON的细胞毒性,并维持细胞的正常形态,具有抗炎和抗氧化的作用。2.DON诱导细胞凋亡和自噬以及YCWE干预DON细胞毒性的分子机制:由于氧化应激是细胞凋亡和自噬的重要因素,因此本研究开展了 DON作用浓度和时间对自噬的影响,建立DON诱导自噬的模型。探究DON对自噬和凋亡影响的同时,探讨YCWE对1 μmol/L DON诱导的细胞自噬和凋亡的影响。结果显示:1)DON能够激活自噬,并上调凋亡蛋白Bax的表达,但随着作用浓度及时间的增加,自噬程度减弱。YCWE与1μmol/LDON共同处理IPEC-J2细胞后,YCWE显著抑制DON诱导的细胞自噬和凋亡的发生。2)利用3-MA、Rap分别作为自噬相关通路的抑制剂和激活剂,研究自噬是否涉及DON对细胞的毒性以及YCWE是否通过调控自噬对细胞具有保护作用。①细胞活性结果表明,3-MA和YCWE均使DON损伤的细胞活力显著增加,Rap使细胞活性显著降低。②氧化指标结果显示,3-MA和YCWE均显著抑制DON诱导的MDA和ROS的上调,抑制GSH下调,Rap使ROS和MDA显著上调,GSH下调。③Western blot检测自噬和凋亡蛋白的表达水平显示,3-MA和YCWE明显逆转了 DON的自噬诱导作用且下调了由DON引起的细胞凋亡。结果表明,DON诱导细胞自噬和凋亡,且DON通过诱导细胞自噬促使细胞凋亡,YCWE则可能是通过下调DON诱导的自噬抑制凋亡的发生。3.ROS-PI3K-AKT-mTOR信号通路在低浓度DON诱导的自噬及YCWE调控自噬中的作用:由于DON诱导氧化应激和自噬,ROS负调控PI3K-AKT-mTOR信号通路,但ROS-PI3K-AKT-mTOR信号通路是否直接参与调控DON诱导的自噬及YCWE干预DON诱导的细胞损伤,并不为我们所知。因此本研究开展了以IPEC-J2为研究对象,1 μmol/LDON单独或与抗氧化通路激活剂(CPDT)、PI3K激活剂(740 Y-P)、PI3K抑制剂(LY294002)、YCWE联合处理细胞12 h,检测IPEC-J2细胞活性、自噬和PI3K-AKT-mTOR信号通路相关蛋白的表达水平,以证明氧化应激和PI3K-AKT-mTOR信号通路均参与DON诱导的自噬及DON诱导的氧化应激调控PI3K-AKT-mTOR信号通路,从而进一步证明DON细胞毒性及YCWE干预DON细胞毒性的分子机制。结果如下:1)细胞活性结果显示,CPDT、YCWE和740Y-P均能使细胞活性显著增加,LY294002使细胞活性显著降低。2)氧化应激参与DON诱导的自噬结果显示,CPDT使自噬相关蛋白LC3-Ⅱ蛋白明显降低,同时P62蛋白表达水平显著增加。3)PI3K-AKT-mTOR信号通路参与DON诱导的自噬结果显示,DON使P-AKT/AKT和P-mTOR/mTOR均显著降低。LY294002使LC3-Ⅱ蛋白明显上调,P62蛋白表达显著下调,同时P-AKT/AKT和P-mTOR/mTOR下调;740Y-P与LY294002结果呈现相反的趋势。4)DON诱导的氧化应激调控PI3K-AKT-mTOR信号通路结果显示,DON使P-AKT/AKT 和 P-mTOR/mTOR 均显著降低。CPDT 使 P-AKT/AKT 和 P-mTOR/mTOR均显著增加。5)ROS-PI3K-AKT-mTOR通路参与YCWE干预DON诱导的细胞自噬结果显示,DON 使 P-AKT/AKT 和 P-mTOR/mTOR 均显著降低。YCWE 使 P-AKT/AKT 和P-mTOR/mTOR均显著增加。综上结果表明,1 μmol/L DON诱导的氧化应激可能是通过调控PI3K-AKT-mTOR信号通路诱导自噬而使凋亡信号通路被激活表现出细胞毒性,而YCWE则可通过抗氧化使PI3K-AKT-mTOR信号通路激活而抑制自噬起到保护细胞的作用。
【学位单位】：武汉轻工大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：TS201.3
【部分图文】：
噬是在不同压力下促进细胞存活的内稳态降解的细胞内过程。然而，自噬还可能逡逑通过过度的“自我消化”导致细胞死亡，被称为“自噬性细胞死亡”［５２］。逡逑自嗤分子过程如图１．２，微管相关蛋白轻链３邋（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ邋ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋１逡逑ｌｉｇｈｔ邋ｃｈａｉｎ邋３，ＬＣ３）是哺乳动物Ａｔｇ８蛋白同源体，被Ａｔｇ４切割以暴露Ｃ－末端甘逡逑氨酸残基，被定义为胞质可溶性ＬＣ３－Ｉ形式；在Ａｔｇ３和Ａｔｇ７的作用下ＬＣ３－Ｉ的逡逑Ｃ末端甘氨酸残基与a愔Ｒ掖及罚ǎ校瑁铮螅穑瑁幔簦椋洌欤澹簦瑁幔睿铮欤幔恚椋睿澹校牛┳汉闲纬慑义希蹋茫常桑桑校牛欢ㄒ逦蹋茫常桑尚问剑⑶遥蹋茫常桑山裘艿亩ㄎ挥谧允商宓哪谕饽ゅ义仙锨也斡胱允膳菽さ难由欤亲允商逯と诤系墓丶街瑁郏担常荆担矗荨＃穑叮驳鞍祝渤棋义衔樱眩樱裕停保＜诤卸喾核鼗鞍拙奂宓陌逯小＃校叮沧魑谓拥鞍子脲义隙嗑鄯核鼗孜锞奂褰岷喜⒂耄蹋茫常桑桑校沤岷希淌赡ぱ由觳⒎獗瘴淌赡义义吓菪纬勺允尚√
本文编号：2812871
【学位单位】：武汉轻工大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：TS201.3
【部分图文】：
噬是在不同压力下促进细胞存活的内稳态降解的细胞内过程。然而，自噬还可能逡逑通过过度的“自我消化”导致细胞死亡，被称为“自噬性细胞死亡”［５２］。逡逑自嗤分子过程如图１．２，微管相关蛋白轻链３邋（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ邋ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋１逡逑ｌｉｇｈｔ邋ｃｈａｉｎ邋３，ＬＣ３）是哺乳动物Ａｔｇ８蛋白同源体，被Ａｔｇ４切割以暴露Ｃ－末端甘逡逑氨酸残基，被定义为胞质可溶性ＬＣ３－Ｉ形式；在Ａｔｇ３和Ａｔｇ７的作用下ＬＣ３－Ｉ的逡逑Ｃ末端甘氨酸残基与a愔Ｒ掖及罚ǎ校瑁铮螅穑瑁幔簦椋洌欤澹簦瑁幔睿铮欤幔恚椋睿澹校牛┳汉闲纬慑义希蹋茫常桑桑校牛欢ㄒ逦蹋茫常桑尚问剑⑶遥蹋茫常桑山裘艿亩ㄎ挥谧允商宓哪谕饽ゅ义仙锨也斡胱允膳菽さ难由欤亲允商逯と诤系墓丶街瑁郏担常荆担矗荨＃穑叮驳鞍祝渤棋义衔樱眩樱裕停保＜诤卸喾核鼗鞍拙奂宓陌逯小＃校叮沧魑谓拥鞍子脲义隙嗑鄯核鼗孜锞奂褰岷喜⒂耄蹋茫常桑桑校沤岷希淌赡ぱ由觳⒎獗瘴淌赡义义吓菪纬勺允尚√
本文编号：2812871
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