西洋参Pq-PPT-6,20-O-UGT和Pq-PPT-6-O-UGT糖基转移酶基因的克隆与功能分析

发布时间：2020-09-16 12:45

　　 西洋参为五加科多年生草本植物,是世界公认的滋补、药食两用植物。西洋参的有效成分为人参皂苷,在强身益智,明目,安精神,止惊悸,延年益寿等方面有着重要的作用。2,3-氧化角鲨烯作为人参皂苷生物合成的中心,分为甲羟戊酸途径和始于丙酮酸的2-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(MEP)的上游途径,以及环化、羟基化、糖基化等修饰过程的下游途径。人参属的药理学活性因人参皂苷的种类和含量的不同而异。糖基化是人参皂苷合成的最后一步,也是赋予人参皂苷特异性、多样性的关键一步。近年来许多学者对人参皂苷合成的葡萄糖基转移酶基因做了许多研究,但西洋参相关葡萄糖基转移酶的研究还不够充分。本文以实验室保存的西洋参愈伤组织为材料,用RT-PCR方法成功的获得三个催化人参皂苷合成的UDP-葡萄糖基转移酶基因序列,并将三个基因与真核表达载体pAUR123连接,转化到酿酒酵母中,通过超声波破碎后,用SDS-PAGE蛋白电泳检测基因表达情况,再用HPLC检测酶促反应产物确定糖基转移酶的功能,最后对发酵温度、时间、摇瓶转速三个条件进行优化培养,具体的研究成果如下:1、糖基转移酶基因的获得。以有质感、生长旺盛的西洋参愈伤组织为材料,用宝生物的全RNA提取试剂盒获取西洋参的总RNA。用RTaseM-MLV酶催化反转录出西洋参的cDNA,以人参中PgUGT100、PgUGT101、PgUGT102和PgUGT103为模板设计简并引物,以cDNA为模板成功克隆出三条序列,经测序后分别确定三条序列均为1428bp,翻译475个氨基酸,编码蛋白质大小均约为53KDa,对他们的氨基酸序列进行序列比对和同源建模后确定得到目的序列,并命名为序列一、序列二和序列三。2、糖基转移酶的异源表达载体构建。将葡萄糖基转移酶基因序列一、序列二和序列三与pAUR123连接,构建了pAUR123-序列一、pAUR123-序列二和pAUR123-序列三三个重组载体,之后转化到INVSc1酿酒酵母中,经菌落PCR和双酶切鉴定后,成功构建Y-pAUR123-序列一、Y-pAUR123-序列二和Y-pAUR123-序列三三个酵母工程菌。3、糖基转移酶表达情况分析。对构建的三个工程菌分别进行发酵培养,用SDS-PAGE蛋白电泳检测工程菌中目的蛋白表达情况,在蛋白电泳图中三个目的蛋白的特征性条带都在53KDa,结果表明三条序列在三个酿酒酵母工程菌中都成功表达。4、将三个重组酵母菌种破碎后的蛋白液作为粗酶液,添加人参皂苷和UDPG后做酶促反应。用液相色谱分析酶促反应产物,序列一可以催化原人参三醇生成F1,再催化F1生成Rg1,因此将序列一命名为Pq-PPT-6,20-O-UGT,并将核酸序列提交到GenBank获得检索号:MK641514,序列二可以催化原人参三醇生成Rh1,因此将序列二命名为Pq-PPT-6-O-UGT,并将核酸序列提交到GenBank获得检索号:MK641515,序列三未检测到催化活性,因此将序列三命名为Pq-PPT-20-O-UGT,并将核酸序列提交到GenBank获得检索号:MK641516。5、工程菌发酵条件优化。从发酵温度、培养时间、摇瓶转速三个方面对工程菌Y-pAUR123-Pq-PPT-6,20-O-UGT和Y-pAUR123-Pq-PPT-6-O-UGT进行优化培养,确定了适宜发酵温度为30℃,适宜发酵时间为38h,适宜摇瓶转速为270rpm。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q943.2;S567.53
【部分图文】：

3-氧化角鲨烯合成的 MVA 途径和 MEP 途径[1]鲨烯在角鲨烯环化酶的催化作用下生成 2,3-氧化角鲨烯，经羽扇豆醇合阿乔醇合成酶的催化下分别生成羽扇豆醇和环阿乔醇等酯类。2,3-氧化β-香树素合成酶、齐墩果酸合成酶催化下，生成齐墩果酸，然后生成齐

人参皂苷下游生物合成途径

糖基转移酶催化通路图

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本文编号：2819869