基于CRISPR-Cas9技术的全基因组敲除筛选体系的建立及其在黄热病毒与宿主相互作用中的初步应用研究

发布时间：2020-09-17 08:57

　　 黄热病毒(Yellow Fever Virus,YFV)是黄病毒科(Flavivirus)的原型病毒,能够导致黄热病的发生。黄热病毒主要流行于南美洲、非洲的热带和亚热带地区,据估计,全球每年有80000至200000人感染黄热病毒,其中有30000至60000人死亡。由于缺乏对YFV与宿主相互作用的分子机制及其致病性的了解,临床上现阶段并无有效的治疗药物。黄热病毒-17D(YFV-17D)是黄热病毒减毒疫苗株,被广泛应用于预防YFV的感染。YFV-17D与Asibi病毒株仅有0.63%的核酸序列差异以及0.94%的氨基酸序列差异。因为它不具备致病性,所以可以在BSL-2的实验室里培养,是研究YFV的理想模型。全基因组功能丧失筛选(Genome-wide Loss-of-Function Screening)是寻找影响特定生物学行为关键基因的重要工具,有助于我们理解生物学行为内在的分子机制。于基于RNA干扰技术的全基因组敲低筛选系统的相比,CRISPR基因敲除技术具有更高效的敲除效率,更低的脱靶效率等优点。近年来,基于CRISPR-Cas9技术的全基因组敲除筛选系统在病毒-宿主相互作用领域中的应用,有助于我们发现调控病毒感染的宿主因子,是理解病毒感染的分子机制的重要工具和研究平台。例如,该筛选体系的应用在西尼罗河病毒(West Nile Virus,WNV)、登革热病毒(Dengue Virus,DENV)等病毒的研究中发现了新的关键宿主因子,为我们理解和治疗这些病毒引发的疾病提供了新的研究线索。本研究旨在建立基于CRISPR-Cas9技术的全基因组敲除筛选体系,将该系统应用于YFV与宿主相互作用的研究中,以发现调控YFV感染的关键宿主因子。我们使用YFV-17D作为建立该系统的病毒模型,包装出具有感染能力的完整YFV-17D疫苗株病毒。首先,我们验证了 YFV-17D可以在人类肝癌细胞系Huh7细胞中完成完整的生命周期,能包装出具有感染能力的完整病毒。因为该细胞株能在感染YFV-17D时出现细胞病理效应(Cytopathic effect,CPE),所以我们选取了 Huh7细胞作为CRISPR-Cas9全基因组敲除筛选调控YFV-17D感染的宿主因子的细胞模型。随后,我们将CRISPR文库 GeCKO(Genome-scale CRISPRKnock-Out)文库包装成慢病毒文库后转导Huh7细胞,并使用YFV-17D进行感染。感染后筛选到对YFV-17D产生抵抗从而存活下来的细胞群,通过对他们所携带的guide RNA(gRNA)进行深度测序,以检测这些细胞中gRNA的丰度,我们鉴定出了数个候选的正向调控YFV-17D感染的宿主因子。其中,靶向基因ZNF629的gRNA具有最多拷贝数和富集。通过建立2株携带靶向ZNF629基因gRNA并对YFV-17D感染产生高抵抗力的单克隆细胞株,我们发现这2株细胞上清培养液中释放的YFV-17D病毒颗粒显著减少,这些初步数据提示ZNF629可能是一个能正向调控YFV-17D感染的宿主因子。在后续实验中,我们还需要验证ZNF629是否为真实的正向调控YFV-17D感染的宿主因子以及对它如何调控其感染的分子机制做深入的研究。综上所述,我们建立了基于CRISPR-Cas9技术的全基因组敲除筛选系统,以Huh7细胞为细胞模型,应用于黄热病毒与宿主相互作用的研究中。我们发现部分Huh7细胞对YFV-17D感染产生抵抗并筛选到了包括ZNF629在内的数个调控该病毒感染的候选宿主因子。本文所建立的应用于YFV与宿主相互作用研究的筛选系统筛选方法简单有效,在YFV研究中有重要的应用价值。
【学位单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R373.33
【部分图文】：

图１．１．邋ＹＦＶ遗传物质和蛋白的结构示意图（图源自参考文献７）。Ａ：邋ＹＦＶ未成熟病毒颗粒的逡逑冷冻电镜示意图。Ｂ：邋ＹＦＶ基因组ＲＮＡ。每种不同颜色代表不同的病毒蛋白，箭头代表形成逡逑的多聚蛋白的切割位点。蓝色箭头代表病毒来源的蛋白酶体切割途径。红色或黑色箭头表示逡逑宿主细胞来源的蛋白酶体切割途径。Ｃ：邋ＹＦＶ翻译形成的多聚蛋白在内质网上跨膜示意图。逡逑２逡逑

邋１邋卜逡逑＂Ａｉｌ邋ｉ？Ａ邋Ａ邋／Ｖ邋Ａ逦ｊｒ＾Ｌ邋ＪＬ逡逑图１．１．邋ＹＦＶ遗传物质和蛋白的结构示意图（图源自参考文献７）。Ａ：邋ＹＦＶ未成熟病毒颗粒的逡逑冷冻电镜示意图。Ｂ：邋ＹＦＶ基因组ＲＮＡ。每种不同颜色代表不同的病毒蛋白，箭头代表形成逡逑的多聚蛋白的切割位点。蓝色箭头代表病毒来源的蛋白酶体切割途径。红色或黑色箭头表示逡逑宿主细胞来源的蛋白酶体切割途径。Ｃ：邋ＹＦＶ翻译形成的多聚蛋白在内质网上跨膜示意图。逡逑２逡逑

３．１邋ＹＦＶ－１７Ｄ疫苗株病毒的建立及滴度测定逡逑为了得到具备感染能力的减毒活黄热病毒１７Ｄ邋（ＹＦＶ－１７Ｄ），我们首先通过体逡逑外转录线性化的具备完整ＹＦＶ－１７Ｄ基因组的ｐＡＣＮＲ－ＹＦＶ－１７Ｄ质粒（图３．１邋Ａ，邋Ｂ），逡逑得到了含有ＹＦＶ－１７Ｄ完整病毒基因组的ＲＮＡ邋（图３．１Ｃ），并通过电转的方法，将逡逑体外转录得到的含有完整病毒基因组的ＲＮＡ转染到Ｈｕｈ７．５细胞株中。病毒ＲＮＡ逡逑转染成功后，病毒基因组会在Ｈｕｈ７．５细胞株中完成自我复制和翻译，从而包装出逡逑具备感染能力的完整病毒颗粒。在转染４８小时后，通过收集细胞培养上清液，并逡逑对其进行浓缩后，分装得到具有感染能力的ＹＦＶ－１７Ｄ病毒颗粒，并对其进行空斑逡逑形成实验（图３．１邋Ｄ），测定所得到的ＹＦＶ－１７Ｄ病毒颗粒的ＰＦＵ值为６．２５ｘ邋１０６邋ＰＦＵ／ｍｌ逡逑（图３．１邋Ｄ），从而确定本实验进行进行病毒感染实验时特定ＭＯＩ值所需要的病毒逡逑颗粒使用剂量。逡逑２４逡逑

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本文编号：2820511