青鱼TAK1基因的分子克隆及功能初探

发布时间：2020-09-18 11:16

　　先天免疫对于硬骨鱼类抵抗病原微生物侵染而言至关重要。转化生长因子β激活激酶1(Transforming growth factor-β-activated kinase1,TAK1)是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族的成员,在NF-κB及AP-1炎症信号通路中起着重要作用,然而TAK1在抗病毒先天免疫IRF/IFN通道中的功能尚不清楚。本论文成功克隆得到青鱼(black carp,Mylopharyngodon piceus)TAK1基因的开放阅读框(open reading frame,ORF),并对青鱼TAK1(bcTAK1)在宿主细胞抗病毒先天免疫应答中的功能进行了研究。bcTAK1基因的开放阅读框含1626个核苷酸,编码541个氨基酸;ExPASy软件预测bcTAK1分子量为75 Kda,等电点为7.55。bcTAK1与草鱼TAK1同源性最高,达到98.5%,并且与哺乳动物TAK1同源性也较高,在结构进化中保守,主要由N端的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域(S/TKc,12-260aa)和C端的卷曲螺旋结构域(Coiled-coil,465-528aa)构成。免疫印迹实验表明:bcTAK1基因在HEK293T细胞和EPC细胞中均能有效表达,但其迁移条带暗示bcTAK1具有糖基化修饰。免疫荧光实验显示:bcTAK1分布于细胞质区域,且具有呈点样分布的特点。双荧光素酶报告基因分析表明:bcTAK1可不同程度的下调青鱼干扰素a(bcIFNa)启动子、斑马鱼干扰素1(DrIFNφ1)启动子、斑马鱼干扰素2(DrIFNφ2)启动子、斑马鱼干扰素3(DrIFNφ3)启动子和胖头鲤鱼干扰素(eIFN)启动子的活性。在EPC细胞中同时过表达bcTAK1和青鱼干扰素调节因子7(bcIRF7)时,bcTAK1可以大幅上调bcIRF7诱导产生IFN的能力。细胞攻毒和噬斑实验结果表明:单独表达bcTAK1的EPC细胞较对照组细胞而言,其抗草鱼呼肠孤病毒(GCRV)和鲤春病毒血症病毒(SVCV)能力未受影响;单独表达bcIRF7的EPC细胞,其抗病毒能力明显得到提升。然而同时表达bcTAK1和bcIRF7的EPC细胞比单独表达bcIRF7的EPC细胞具备明显增强的抗病毒能力。综上所述,本论文揭示了bcTAK1在青鱼抗病毒先天免疫反应中具备正向调节bcIRF7诱导产生IFN的能力的作用和正向调控bcIRF7介导的抗病毒活性的功能,这在脊椎动物乃至人类中是首次发现。
【学位单位】：湖南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S917.4;Q78
【部分图文】：

区域图,区域,结构域,相似度

26图 3-1：bcTAK1 的 ORF 区域。bcTAK1 的 ORF 由 1626 个核苷酸组成，预测 bcTAK1 的蛋白包含 541 个氨基酸。画框的是 S/TKc 结构域（12-260aa），阴影部分的是 Coiled-coil 结构域（465-528aa）。蛋白结构域的预测是通过在线软件 Simple Modular Architecture ResearchTool (SMART) (http://smart.embl-heidelberg.de/)数据库。Fig. 3-1: ORF region of bcTAK1. The ORF of bcTAK1 consists of 1626 nucleotides, and theprotein predicted bcTAK1 contains 541 amino acids. The frame is the S/TKc domain (12-260aa),and the shaded part is the Coiled-coil domain (465-528aa). The protein domain is predicted by theonline software Simple Modular Architecture Research Tool (SMART)(http://smart.embl-heidelberg.de/) database.3.2 bcTAK1 的进化史研究为了进一步分析 TAK1 基因的进化史，本研究将 bcTAK1 的氨基酸序列与其它物种的 TAK1 氨基酸序列进行了比对，包含了 NCBI 上很多已知的序列（表2）。比对表的结果表明青鱼的 TAK1 与果蝇的 TAK1 同源性最低，只有 43.9%，相似度也是仅有 30.4%，紧接着是与致倦库蚊的 TAK1，同源性 46.4%，相似度

脊椎动物,进化树,物种,选用方法

图 3-2：脊椎动物 TAK1 的进化分析。使用软件 MEGA6 和 GeneDoc 对脊椎动物 TAK1 的氨基酸序列进行进化分析（A），TAK1 序列来自以下物种：H. sapiens (AAV38460.1), M.musculus (NP_033342.1), G. gallus (XP_015140171.1)和青鱼 TAK1。通过软件 MEGA 6 构建的进化树（B），选用方法是 NJ （Neighbor Joining）邻接法，TAK1 序列来自以下的物种：P. paniscs (XP_008974742.1), M. musculus (NP_033342.1), P. troglodytes (XP_009449928.1),R. norvegicus (NP_001101390.2), S. scrofa (APX52954.1), H. sapiens (AAV38460.1), B.taurus (NP_001075064.1), G.. gallus (XP_015140171.1), X. laevis (NP_001084359.1), P.olivaceus (AJE25832.1), E. coioiaes (AGQ48129.1), D. rerio (NP_001018586.1), C. idella(AGI51677.1), O. niloticus (XP_005475207.1), P. lividus (ABF82443.1), C. intestinalis(NP_001071829.1) and C. quinquefasciatus (XP_001848119.1)。标尺代表着规模长度，进化树不同分支上的数字代表建立进化树后，分支符合度的百分数。Fig. 3-2: Evolution of vertebrate TAK1. (A) Comparisons of bcTAK1 with other vertebrate TAK1protein sequences by using MEGA 6.0 program and GeneDoc program, which including: H.sapiens (AAV38460.1), M. musculus (NP_033342.1), G. gallus (XP_419832.3), and M. piceus. (B)The phylogenetic tree was constructed by the software MAGE6, NJ (Neighbor Joining) methodwas selected, the TAK1 sequence is from the following species: P. paniscs (XP_008974742.1), M.musculus (NP_033342.1), P. troglodytes (XP_009449928.1), R. norvegicus ( NP_001101390.2), S.scrofa (APX52954.1), H.

氨基酸序列,蛋白表达,细胞

为了了解 bcTAK1 蛋白的体外过表达情况，本研究构建了能表达 bcTAK1 蛋白的重组质粒，它们分别是 pcDNA5-FRT/TO-Flag-bcTAK1 和pcDNA5-FRT/TO-bcTAK1-Flag。因为 HEK293T 细胞能够高效表达外源基因，而EPC 细胞又可以作为很好的鱼类实验细胞，所以选取这两种细胞进行真核表达实验。分别将重组质粒转染入 HEK293T 细胞和 EPC 细胞，转染后 48 h 收细胞，使用全细胞裂解液进行 Western-Blot。和预测的蛋白大小 75KDa 相比，实际采用鼠抗（Flag）检测到的 bcTAK1 稍微大一点点，这可能是蛋白存在了一定的修饰，有趣的是，在 EPC 细胞中过表达的 bcTAK1 有很明显的五条带（图 3-3-A），据此推测 bcTAK1 蛋白可能存在糖基化或者磷酸化之类的修饰，因为在 bcTAK1 的氨基酸序列中存在五个符合 N-X-S/T 公式的 N-连接的糖基化位点，分别为：N181、N318、N405、N425、N513。然而，在 HEK293T 细胞中这些条带并不是太明显，猜测可能是因为 HEK293T 细胞中蛋白表达量较大，导致蛋白条带变粗，最终连在一起，看起来较模糊（图 3-3-B）。

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