盐地碱蓬SsNRT1.7在硝态氮再利用过程中的功能研究

发布时间：2020-09-18 17:11

　　盐地碱蓬(Suaeda salsa L.)是一种具有高耐盐性的真盐生植物,在潮间带和内陆生境中长势良好,但其生长环境中特别是潮间带生境土壤中的NO_3~-含量非常低,但目前尚不清楚这两种生境的盐地碱蓬是如何适应低氮环境的。本文探究了两种生境盐地碱蓬对低氮环境适应的生理及分子机制。结果如下:1.N饥饿对盐地碱蓬NO_3~-由源到库再利用的影响将两种生境盐地碱蓬在200 mM NaCl条件下用1 mM NO_3~--N预培养。然后将幼苗用1 mM NO_3~--N和无N溶液(N饥饿)一起培养14天后,测定与NO_3~-再利用相关基因的表达、NO_3~-和叶绿素含量、净光合速率以及生物量。结果表明,N饥饿处理后,与内陆生境相比,潮间带生境盐地碱蓬SsNRT1.7在老叶和成熟叶中的表达显著上调,但在幼叶中并非如此。并且潮间带生境NO_3~-和叶绿素含量、幼叶净光合速率和地上部干重的下降幅度均低于内陆生境。因此,与N饥饿处理后的内陆生境相比,SsNRT1.7可能在潮间带生境的老叶或成熟叶的NO_3~-再活化过程中发挥了更重要的作用。因此,在低氮环境中,相比于内陆生境,潮间带生境幼叶中更多的NO_3~-能够更好地维持光合作用。2.盐地碱蓬NO_3~-再利用相关基因SsNRT1.7的全长克隆根据盐地碱蓬转录组测序结果得到的NO_3~-再利用相关基因NRT1.7信息,克隆得到中间序列(暂命名为SsNRT1.7),将该序列进行blast比对分析,结果显示该序列与甜菜的NRT1/PTR FAMILY2.12蛋白的相似度为81%。以该序列为基础通过3'RACE和5'RACE技术扩增得到SsNRT1.7基因的全长2375 bp,CDS区1851 bp。编码区与拟南芥AtNRT1.7编码区的同源性为55.83%。3.盐地碱蓬SsNRT1.7的生物信息学分析及亚细胞定位SsNRT1.7编码617个氨基酸。对该蛋白进行理化性质分析,该蛋白为疏水稳定蛋白;将其氨基酸序列进行SMART分析,存在PTR2保守结构域;用TMHMM软件对蛋白的跨膜结构进行分析,该蛋白存在12个跨膜结构域;利用MEGA软件对该基因的蛋白序列进行系统进化分析,发现该蛋白与甜菜、菠菜、藜麦的亲缘关系最近。将SsNRT1.7基因连接到表达载体pCAMBIA1300-35S-sGFP上,经农杆菌转化测序成功后,对烟草进行瞬时转化,用双光子激光扫描共聚焦显微镜观察烟草表皮细胞内SsNRT1.7和GFP的融合表达情况。结果显示,转空载体pCAMBIA1300-35S-sGFP的细胞内布满了绿色荧光,而转SsNRT1.7的烟草表皮细胞只有细胞膜有绿色荧光,表明SsNRT1.7定位于细胞膜。4.拟南芥AtNRT1.7突变体、SsNRT1.7转基因纯合株系的筛选我们选取SALK_022429拟南芥突变体株系,利用双引物法进行鉴定,获得了SALK_022429纯合植株。将SsNRT1.7基因连接到表达载体pCAMBIA1300-35S-sGFP上,经农杆菌转化测序成功后,对纯合突变体植株和WT植株进行花序侵染,获得过表达和回补植株,利用潮霉素抗性筛选出阳性植株,并进行DNA水平的验证,最终获得纯合过表达和回补株系,并根据荧光定量PCR结果筛选出表达量较高的株系。
【学位单位】：山东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q943.2
【部分图文】：

生理功能,拟南芥,硝酸盐,植物体

图 1 拟南芥硝酸盐转运蛋白的生理功能（Fan et al., 2009）Fig. 1 Physiological function of Arabidopsis nitrate transporter皮细胞吸收的 NO3-主要通过四种途径发挥作用：（1）在根部酸或酰胺，用于维持植物体的正常生长代谢。（2）直接以 NO导管转运至植物的其他器官而发挥作用。（3）作为储存状态储界氮素营养不足时释放出来维持植物体的生长。（4）重新返回organ et al., 1973）。对 NO3-的重新利用生长介质中氮营养充沛时，植物会以超过其生长代谢所需的量存起来。当生长后期植物的需氮量大而吸收量难以满足或是遭

生境,叶位,叶片,保守区

1-1 两种生境盐地碱蓬叶片取材叶ple of leaf position in the plants of two利用相关基因的筛选及表O3-再利用相关基因的表达情况，O3-再利用相关的基因，然后将SsNRT1.7，下同）的保守区，用 N 饥饿处理后提取叶片总 RNA，

饥饿,生境,潮间带,老叶

山东师范大学硕士学位论文处理对盐地碱蓬 NO3-再利用相关基因表达量的影中利用荧光定量PCR分析了SsNRT1.7基因在N饥饿处理化。结果显示，在潮间带生境中，与对照相比（1 mM NO3--、成熟叶和新叶中 SsNRT1.7 的表达量均出现了上调，尤。在内陆生境中，N 饥饿使老叶和幼叶中的 SsNRT1.7 出有影响。N 饥饿对老叶中 SsNRT1.7 的诱导表达在潮间带，即在潮间带和内陆种群中，N 饥饿植物老叶中 SsNRT1的 2.88 和 1.48 倍（图 1-2）。

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