黄花棘豆抗逆转录因子OoABF2互作蛋白的筛选与鉴定

发布时间：2020-09-28 17:09

　　近年来,草场退化现象不断加剧,严重影响了生态平衡和可持续发展,而黄花棘豆作为主要的草原毒害草之一,由于其自身极强的抗逆性和适应性而广泛蔓延。本课题前期对黄花棘豆在3种逆境胁迫(ABA,NaCl和PEG)处理下的转录组数据分析显示ABF2类转录因子可能参与黄花棘豆的抗逆反应,但其调控机理仍不清楚。因此,本研究以前期工作为基础,以黄花棘豆转录因子OoABF2为切入点,对其上游互作进行蛋白筛选与鉴定,为探明黄花棘豆抗逆性的分子机制提供理论依据。(1)本研究以OoABF2转录因子(accession number:KU877410.1)为切入点,结合课题组已有研究工作和国内外文献报道,首先确定SnRK2s蛋白激酶家族为目标基因,随后成功克隆出黄花棘豆中的所有8个SnRK2s激酶家族:暂时命名为OoSnRK2.1-OoSnRK2.8(accession number:MH636330-MH636337)。(2)通过T4 DNA连接酶分别将OoABF2和pGADT7连接,将OoSnRK2s与pGBKT7连接,构建真核重组质粒,利用酵母双杂交技术,在酵母细胞体内筛选鉴定出了与OoABF2转录因子相互作用的SnRK2激酶蛋白为OoSnRK2.1和OoSnRK2.6。(3)构建OoSnRK2.1-pSPYNE、OoSnRK2.6-pSPYNE和OoABF2-pSPYCE重组质粒,利用双分子荧光互补技术,在烟草表皮细胞内再次体内验证了OoABF2转录因子与OoSnRK2.1和OoSnRK2.6存在相互关系,且相互作用位点都在细胞核。(4)将OoSnRK2.1和OoSnRK2.6分别与pGEX-4T-1连接,将OoABF2和pET-32a连接,通过原核诱导表达出3个可溶性的目标蛋白,通过Pull-Down技术在体外进一步确证了OoABF2转录因子与OoSnRK2.1和OoSnRK2.6为互作蛋白。(5)综合利用各种生物信息学方法对OoSnRK2.1和OoSnRK2.6基因进行生物信息学分析,解析了这两个蛋白的基本理化性质,结果表明目标蛋白都是亲水性蛋白,都没有跨膜结构域和信号肽,都是核定位蛋白,都包括特定的保守结构域,都含有磷酸化位点。通过构建系统进化树发现OoSnRK2.1蛋白与蒺藜苜蓿(XP 003615157.1)以及鹰嘴豆(XP 004490378.1)蛋白的一致性最高;OoSnRK2.6蛋白也与蒺藜苜蓿(XP013456889.1)蛋白序列同源性最高。(6)在3种不利胁迫(ABA,NaCl和PEG)处理下,运用qRT-PCR技术对目标基因OoSnRK2.1和OoSnRK2.6进行表达谱分析,结果表明:两者都能够由ABA激活,并且同时在3 h处达到较高的转录水平,在NaCl和PEG的处理下,OoSnRK2.1和OoSnRK2.6也能够被诱导表达,结果表明二者可能主要通过依赖ABA信号途径参与抗逆反应。综上所述,本研究表明黄花棘豆OoABF2转录因子和其上游的OoSnRK2.1/OoSnRK2.6激酶家族通过依赖于ABA的信号通路在逆境胁迫中发挥了重要的作用,对于揭示和阐明黄花棘豆抗逆机制具有重要的意义。
【学位单位】：西北大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q943.2;S812.6
【部分图文】：

水分胁迫,转录因子,激酶,西北大学

西北大学硕士专业学位论文路可简单概括为 PYR/PYL/RCARs→PP2C→SnRKs→AREB/AB。水分胁迫下 AREB/ABF 作为核心组分参与的 ABA 依赖性途径 PP2Cs 与 SnRKs 结合使其去磷酸化，SnRKs 激酶失活，最终 A断；受胁迫时，植物体内 ABA 含量上升，能够与受体结合成复合2Cs 对 SnRKs 的抑制作用，从而激活 SnRKs 激酶。SnRKs 以磷酸游 AREB/ABF，进而激活 ABA 信号途径，诱导相关靶基因表达[

样品质量,纯度高,检测数据,值分布

分析豆总 RNA 样品质量检测RNzol 法，按照方法 2.2.3 的方法提取黄花棘豆总 RNA，利用 Nan结果显示，OD260/280值分布在 1.8-2.1 区间，OD260/230在 2 以上，/μl（如表 2.5），以上结果均说明植物总 RNA 浓度和纯度较高。琼显示，28S 条带亮度最高，5S 条带亮度极弱（如图 2.1），这些结果 RNA 没有降解和污染，纯度高，完整性好，完全可用于后续实验表 2.5 黄花棘豆总 RNA 检测数据Tab.2.5 Total RNA data of the O. ochrocephala 浓度（ng/μl） OD260/280OD260/21114.41 2.08 2.01902.50 2.05 2.07631.69 1.86 2.16

生物信息学,预测目标,相互作用,数据库

西北大学硕士专业学位论文Fig.2.1 Figure of O. ochrocephala total RNA agarose electrophoresis附注：M: DL2000（bp）；样品 1、2、3 为所提取 RNA 的 3 个生物学平行重复3.2 蛋白间相互作用预测分析利用在线软件，利用生物信息学的方法预测 OoABF2 转录因子与 OoSnRK2s 蛋是否存在相互作用，预测结果显示，黄花棘豆 OoSnRK2s 与拟南芥气孔开放因子ST1（AtSnRK2.6）有较高的一致性，黄花棘豆 OoABF2 与拟南芥 ABF2 蛋白也有高的一致性，而 OST1 与 ABF2 已被证实存在相互作用（如图 2.2），这为研究黄花豆目标蛋白的互作关系提供了有力的理论依据。

【相似文献】