拟南芥钙调蛋白CBP60g在大肠杆菌和昆虫细胞内的表达与纯化

发布时间：2020-09-29 20:56

　　植物通过调节胞内钙离子浓度对外界不良环境因素进行防御。钙调素(CaM)是一类最主要的钙离子感受器,钙离子-钙调素(Ca2+-CaM)复合体与钙调素结合蛋白(CBPs)结合构象发生变化后参与植物对生物和非生物胁迫的响应。CBP60g蛋白作为CBPs蛋白家族中的重要一员,在抗病、抗旱、正向调节ABA和SA介导的信号途径以及负调控花青素的合成过程中起着非常重要的作用。本研究尝试了在大肠杆菌和昆虫细胞内进行可溶性表达和纯化拟南芥CBP60g蛋白,期望为今后解析其三维结构提供依据。具体结果如下:1.对CBP60g的氨基酸序列进行分析和预测表明,其含有11个糖基化位点、76个磷酸化位点、没有跨膜结构域。2.以野生拟南芥cDNA为模板,利用PCR扩增技术得到拟南芥CBP60g故基因,其cDNA 全长为 1689 bp。3.利用TEV-LIC技术分别构建大肠杆菌表达载体,并转化到表达菌株BL21(DE3)。经不同浓度IPTG进行诱导,SDS-PAGE检测发现,目的蛋白CBP60g主要以包涵体的形式存在。4.成功构建杆状病毒转移载体,转化到E.coli DH1OBac后得到重组杆状病毒质粒,转染到昆虫细胞中进行表达蛋白。SDS-PAGE检测目的蛋白大小约为75 KDa,比预测蛋白大小(62 KDa)略大。经过阴离子交换纯化后,根据所建立的蛋白标准曲线计算蛋白浓度为996.5 ng/mL,经过Western Blotting验证,所纯化的蛋白质为CBP60g。
【学位单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q78
【部分图文】：

模式图,转导,模式,钙离子

钙感成蛋白通过钙离子应答启动子元件接收到钙信号后，在通过激活钙离子调节的逡逑靶酶与Ｃａ２＋受体蛋白相互作用，进行解码和转导，通过受体蛋白将钙离子浓度变化逡逑所蕴含的外界信息表达为生理生化过程＂８］。如图１所示，当钙调素ＣａＭ７过表达后，逡逑通过与ＤＮＡ结合的方式，从而使光诱导基因的表达量增加和高光形态发生。ＣＡＭ逡逑ＴＡ３是真核生物中依赖性钙调蛋白结合转录因子，Ｃａ２＋／ＣａＭ的复合体与ＣＡＭＴＡ结逡逑合后，通过调控冷调节基因的ＣＢＦ启动子从而促进植物冷冻耐受性。ＣＰＫ３和ＣＰＫ６逡逑在ＡＢＡ中的作用为调节气孔关闭和保卫细胞Ｓ型阴离子通道。ＣＤＰＫｓ通过ＮＡＤＰＨ逡逑的调节产生ＲＯＳ氧化酶。ＣＢＬ钙传感受器Ｓ０Ｓ３邋（ＡｔＣＢＬ４）和ＣＩＰＫ型激酶Ｓ０Ｓ３逡逑（ＡｔＣＩＰＫ２４）通过调节Ｎａ＋／Ｈ＋反转运子Ｓ０Ｓ１进而特异性调节盐胁迫适应的调节信逡逑兮通路。逡逑

氨基酸序列,复合物,钙调素

ｎｍ长的分子［２３］。Ｎ－末端和Ｃ－末端的环区域和两端的ａ螺旋区形成典型的螺旋－环－逡逑螺旋ＥＦ手型结构域。中央非螺旋区由７８？８１氨基酸残基构成［２４］，具有很强的延展逡逑性，使其可以与不同空间结构的靶蛋白相结合，如图２所示。逡逑钙调素本身没有催化活性。当疏水性区域暴露，ＥＦ手型结构域结合Ｃａ２＋，并通逡逑过钙调素结合结构域与钙调素结合蛋白相互作用［２５］。目前，从拟南芥、玉米、烟草、逡逑水稻、小麦等多种植物中分离出的钙调素氨基酸序列是高度保守的［２６２７］。植物中存逡逑在多种钙调素基因，编码相同蛋白质或者类似蛋白质，称为钙调素亚型。钙调素亚逡逑型与哺乳动物氨基酸序列同源性约为９０％，钙调素亚型的存在使钙信号的转导信号逡逑途径变得更加丰富有趣。钙调素对细胞分裂的调控与生长素的调节起到作用，对植逡逑物的衰老死亡起到很重要作用。有研究表明植物细胞外还含有钙调素和钙调素结合逡逑

原理图,杆状病毒,转座,原理

ｐＦａｓｔＢａｃ？表达质粒转入ＤＨｌＯＢａｃ细胞中，ｐＦａｓｔＢａｃ？菌株上的单位ｍｉｎｉ－Ｔｎ７与耙位逡逑点ｍｉｎｉ－ａｔｔＴｎ７发生重组。将构建成功的重组杆状病毒质粒，感染处于生长对数期的逡逑细胞以产生含有目的基因的重组病毒，如图４所示。Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｈｉｇｈ邋Ｆｉｖｅ为常用的逡逑细胞宿主。杆状病毒具有许多真核蛋白的加工修饰方式，如折叠、寡聚化、磷酸化、逡逑糖基化、酞化、二硫键形成、溶蛋白性裂解等。逡逑

【参考文献】