蕨类植物氧甲基转移酶的功能研究

发布时间：2020-09-29 23:38

　　 蕨类植物作为最早的维管植物,介于低等植物和高等植物之间,而且形态结构多样,常被用来作为研究植物进化和系统发育的重要对象。木质素是植物细胞壁的主组成成分,在植物的生长发育中起到了重要的作用。木质素是由木质素单体聚合而成,木质素单体的生物合成过程中氧甲基化是一步非常重要的反应。植物体内参与木质素单体生物合成的氧甲基转移酶有两种:咖啡酸氧甲基转移酶(Caffeic acid O-methyltransferases,COMTs)和咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶(Caffeoyl CoA O-methyltransferases,CCoAOMTs),都属于S-腺苷-L-甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine,SAM)作为甲基供体的氧甲基转移酶(O-methyltransferases,OMTs)。CCoAOMTs主要在高等植物里被鉴定。目前,在江南卷柏中克隆鉴定了 1个COMT基因,参与木质素生物合成的CCoAOMTs基因的研究在蕨类植物中还未发现。为了研究蕨类植物中Ⅰ型OMTs的进化以及功能,本论文从厚囊蕨,原始薄囊蕨和薄囊蕨中共选取了 51种蕨类植物的转录组数据,从中搜索注释为CCoAOMT的基因。结果显示,在厚囊蕨中没有CCoAOMTs基因的存在,有4个基因属于原始薄囊蕨,37个基因属于薄囊蕨。将这些基因进行系统发育树分析,结果表明,友水龙骨(Polypodiodes amoena)和铁线蕨(Adinatum Capillus-veneris)中各有一个CCoAOMT基因位于原始薄囊蕨基因进化支的根部,各有一个CCoAOMT基因位于薄囊蕨基因进化支的中间部位,于是将这4个基因进行进一步的功能研究。首先将这4个基因分别命名为 PaCCoAOMT1、PaCCoAOMT2、AcCCoAOMT1和AcCCoAOMT2,并将其序列输入到NCBI网站上进行BLAST显示,它们都属于Ⅰ型氧甲基转移酶家族。利用PCR技术分别从各自植物的cDNA中克隆得到完整的ORF,并翻译成相应的氨基酸序列,与苜蓿MsCCoAOMT进行序列比对和进化树分析发现,这4个OMT基因进化上位于高等植物真正的CCoAOMT进化支的根部,与MsCCoAOMT的序列相似性都在60%以上。利用基因重组技术将4个CCoAOMT基因分别构建到原核蛋白表达载体上,经过IPTG诱导表达获得可溶的重组蛋白并进行体外酶活实验,以苜蓿的MsCCoAOMT蛋白活性作为对照。酶活结果显示,4个CCoAOMT基因对黄酮类化合物均具有较高的催化效率,可以特异性的甲基化黄酮B环上的3'位羟基,以及A环上6位羟基,对于B环上含有单个羟基的芹菜素、柚皮素和山奈酚均不具催化特性,具有邻苯二酚结构间位氧甲基化的催化特点。对于苯丙素类化合物,4个CCoAOMT均对咖啡酰-CoA催化活性最高,且转化率与MsCCoAOMT相当。通过烟草下表皮瞬时表达实验对PaCCoAOMTs-GFP融合基因进行了亚细胞定位研究,结果表明PaCCoAOMTs基因都定位在细胞质中。为了进一步研究蕨类植物中CCoAOMTs基因在植物体内的功能,分别将PaCCoAOMT1和PaCCoAOMT2构建入植物表达载体,并转入了模式植物拟南芥中,对转基因植株中木质素和黄酮醇的含量进行测定,并与野生型植株进行比较,发现转基因植物中的木质素含量明显增高,而氧甲基化黄酮醇的含量没有明显的差异。说明PaCCoAOMTs基因在植物体内参与木质素的生物合成,不参与黄酮醇氧甲基化反应。本课题鉴定了 4个参与木质素单体和黄酮氧甲基化的CCoAOMT基因,有助于理解CCoAOMT基因的进化以及木质素的起源与演化。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q946.5
【部分图文】：

松树［７２，７３］，杨树［７４＿７６］，红花［７７］和亚麻［７８］等。在苜蓿（Ｍｅ沿⑶ｇｏ血／似）的逡逑研宄中，已经获得了苜蓿中ＣＣｏＡＯＭＴ基因的蛋白晶体结构，鉴定出了影响与逡逑底物结合以及与ＳＡＭ和Ｍｇ２＋结合的关键氨基酸位点（图１－１）。逡逑图１－１邋ＭｓＣＣｏＡＯＭＴ－ＣＣＯＡ复合晶体三维结构逡逑据报道，在对拟南芥的研宄中，对拟南芥中的ＣＣｏＡＯＭＴ进行突变，通过逡逑分析木质素的含量表明，突变体植株中的木质素含量比野生型明显减少，且Ｇ木逡逑质素的含量也相对下降［７９］，这进一步证明了邋ＣＣｏＡＯＭＴ参与了木质素合成，尤逡逑其是对Ｇ木质素的生物合成具有重要作用。对拟南芥、水稻和杨树全基因组的逡逑分析表明，拟南芥、水稻和杨树中分别有１０个、９个和６个ＣＣｏＡＯＭＴ序列，逡逑１１逡逑

的研究表明，木质素单体合成需要一系列细胞色素Ｐ４５０依赖性单加氧酶（Ｐ４５０ｓ）逡逑和Ｓ－腺苷－Ｌ－甲硫氨酸（ＳＡＭ）依赖性０－甲基转移酶（ＯＭＴｓｆｌ邋Ｇ－木质素的单逡逑体是松柏醇（图１－２），ＣＣｏＡＯＭＴ可以甲基化咖啡酰辅酶Ａ邋３－ＯＨ生成阿魏酰辅逡逑酶Ａ，进一步还原生成松柏醇，所以它们在裸子植物和被子植物的Ｇ－木质素单逡逑体的甲基化中起重要作用。Ｓ－木质素单体是芥子醇，可以由肉桂醇脱氢酶逡逑（ｃｉｎｎａｍｙｌ邋ａｌｃｏｈｏｌ邋ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，邋ＣＡＤ）催化芥子醛而来，ＣＯＭＴ邋可以甲基化邋５－逡逑ＯＨ松柏醛的５位羟基，生成Ｓ－木质素单体的前体物质芥子醛，所以ＣＯＭＴ主逡逑要参与合成裸子植物以及被子植物中的Ｓ－木质素的生成。ＣＣｏＡＯＭＴ和ＣＯＭＴ逡逑在植物体内的表达，对木质素这种聚合物的结构完整性至关重要［９９］。逡逑１３逡逑

PaCCoAOMTs和AcCcoAOMTs的蛋亡

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本文编号：2830426