大豆GmWRI1a基因启动子克隆及其功能分析

发布时间：2020-09-30 10:59

　　 高等植物的启动子是构成基因表达载体的重要元件,影响外源基因在植物体内的表达。启动子的序列中包含着许多顺式作用元件,在转录水平上能够调控相应下游基因的表达,从而增强植物对外界复杂生长环境的适应能力。对植物启动子的研究,有助于了解基因转录调控表达模式及其调控机制,还可直接应用于植物基因工程中提高或改进外源目的基因的表达。AP2/EREBP转录因子在抗寒、抗旱、耐高温、耐盐等逆境胁迫中有重要作用,而且还可调节植物对激素如乙烯(ETH)和赤霉素(GA_3)等的应答反应,在植物抗逆境胁迫中起重要作用。WRINKLED1(WRI1)转录因子,含有2个AP2结构域,属于AP2/EREBP家族一员。WRI1转录因子在调控脂肪酸代谢过程中也起到关键作用,控制着种子中从糖到油合成的碳源流。本课题组前期从大豆中克隆GmWRI1a基因,该基因通过调控大豆脂肪酸合成代谢途径的相关基因BCCP2、FAE1、KAS1、ACP1等和糖酵解代谢途径相关基因Pl-PKβ1、PDHE1α等提高大豆种子含油量,此外该基因还参与了大豆抗旱和耐盐碱胁迫反应。而通过对该基因启动子的研究,能够进一步鉴定该基因的功能。所以为了探究GmWRI1a基因的功能,本研究提取大豆东农47基因组DNA,分离大豆GmWRI1a基因的启动子pGmWRI1a,定向替换CAMV35S(Cauliflower mosaic virus35S)组成型启动子,驱动下游GUS基因的表达。并通过5’端缺失法构建pGmWRI1a启动子缺失片段表达载体转化模式植物拟南芥,对GmWRI1a基因启动子分子结构及功能进行了分析,初步阐明了pGmWRI1a启动子调控基因表达的分子基础,探究了pGmWRI1a启动子在植物生长中的调控作用,为深入研究GmWRI1a基因的功能奠定了良好的基础。研究结果如下:1.应用PCR技术克隆了大豆GmWRI1a基因的启动子pGmWRI1a,通过在PLACE网站上对启动子全长1669 bp的序列进行分析,发现该启动子不仅含有TATA-box、CAAT-box核心启动子区域,还存在多种顺式作用元件,如含有与乙烯有关的基序(ERE),与赤霉素有关的基序(P-box、GARE-motif),与茉莉酸有关的基序(CGTCA-motif),ABA响应元件CE3和光响应元件G-box、GA-motif、ACE、AE-Box、ATC-motif、CATT-motif和GT1-motif等。2.构建了GmWRI1a基因的启动子植物表达载体并转化拟南芥,在正常培养条件下,通过GUS组织化学染色试验发现,GmWRI1a启动子能够驱动GUS基因在拟南芥的根、茎、叶、花中表达。在转基因拟南芥幼苗时期的下胚轴表达较弱。在花瓣、雄蕊和雌蕊柱头都有表达。结果表明:GmWRI1a启动子在转基因拟南芥整个生育期均能驱动GUS基因表达。3.根据pGmWRI1a启动子主要顺式元件的分布,采用启动子5’端缺失法,分别扩增得到4个pGmWRI1a启动子5'端缺失片段1138 bp,1087 bp,690 bp和437 bp构建植物表达载体,并利用花序法转化拟南芥。通过启动子转录起始位点的预测和各启动子缺失片段驱动GUS报告基因的表达结果,初步确定pGmWRI1a启动子转录起始位点位于-690～-437 bp之间。并分别利用2 mM赤霉素、0.1 mM茉莉酸及0.2 mM乙烯处理转基因拟南芥,通过GUS酶活性检测,初步确定乙烯的响应元件位于-1138～-1087 bp之间,茉莉酸的响应元件位于-1087～-690 bp,赤霉素的响应原件位于-690～-437 bp之间,干旱的响应原件位于-1087～-690 bp之间。4.利用2 mM赤霉素、0.1 mM茉莉酸及0.2 mM乙烯处理大豆DN47植株,经过qRT-PCR检测发现GmWRI1a基因受赤霉素和乙烯的正向调控,而茉莉酸对GmWRI1a基因没有明显的调控作用。
【学位单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S565.1;Q943.2
【部分图文】：

东北农业大学农学硕士学位论文GUS 组织染色，确定 GmWRI1a 基因启动子在植株中的表达情况。同时，根据预测的 GmWRI1a启动子顺式作用元件位置，利用启动子缺失实验分析启动子的功能。通过探究 GmWRI1a 启动子的功能以及在植物生长中的调控作用，为深入探究大豆 GmWRI1a 基因功能及调控机制奠定了良好的基础。1.8 技术路线

以 SDS 小量法提取的大豆 DN47 基因组 DNA（图 3-1）作为模板，以 GmWRI1a-1WRI1a-1669-R 为引物，PCR 扩增 GmWRI1a 基因启动子序列。将 PCR 反应液上电泳检测，结果表明，在约 1700 bp 处有清晰的条带（图 3-2），选取条带正确胶回收，克隆到 pMDTM18T 载体，转化大肠杆菌后挑取单菌落送至北京华大序。测序结果显示，测序片段大小为 1669 bp，与 GmWRI1a 基因预测启动子序，证明已经克隆到了 GmWRI1a 基因启动子序列，命名为 pGmWRI1a。图 3-1 DN47 大豆植株 DNA 提取Fig. 3-1 Extraction of DNA from DN47 cultivar

24注：序列中可能的顺式作用元件用方块和灰色阴影标出；下画线 ATG 为 GmWRI1a 基因的起始密码子Note: Possible cis-acting elements in the sequence are indicated by squares and shades of gray; the lower line ATGis the start codon of the GmWRI1a gene.图 3-3 GmWRI1a 基因启动子序列分析Fig. 3-3 Sequence analysis of GmWRI1a gene promoter

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 贺飞燕;闫建俊;白云凤;冯瑞云;施俊凤;;启动子的类型及应用[J];山西农业科学;2017年01期

2 聂永强;马晴雯;;哺乳动物可变启动子的功能及其与疾病的关系[J];上海交通大学学报(医学版);2017年04期

3 范荣;刘金雷;韩武洋;许湄雪;陆浩;仪宏;李天明;;谷氨酸棒状杆菌新型诱导启动子的研究[J];海南师范大学学报(自然科学版);2016年02期

4 雒雅婧;李杰;张爽;杜克久;;植物启动子研究进展[J];北方园艺;2015年22期

5 孔维文;程嘉;李斌;骆中正;吴飞;刘爱新;;植物受病原物诱导启动子概述[J];植物保护学报;2014年02期

6 孔维文;王丹丹;刘爱新;;串联双病原物诱导启动子驱动基因表达的特性[J];植物病理学报;2013年04期

7 高刚;鲁艳芹;韩金祥;赵丽;;双启动子对增强型绿色荧光蛋白表达的影响[J];中国生物制品学杂志;2009年10期

8 刘芳;蒋外文;陈翔;;粗糙集理论在启动子识别中的应用研究[J];计算机与数字工程;2008年04期

9 刘晓琳,王刚,化冰,王琰;启动子控制严密性对抗体库多样性影响的研究[J];中华微生物学和免疫学杂志;2001年06期

10 刘晓琳,王刚,化冰,王琰;启动子控制严密性对抗体库多样性影响的研究[J];海军总医院学报;2001年03期

相关会议论文 前10条

1 萧凤回;段承俐;薛刚平;;快速检测干旱和脱水可诱导植物启动子瞬间表达特性的方法[A];中国遗传学会七届一次青年研讨会暨上海高校模式生物E——研究院第一届模式生物学术研讨会论文汇编[C];2005年

2 龙海涛;李洪清;李玲;;蓝猪儿捕获启动子系统建立[A];2006中国植物细胞发育与分子生物学学术研讨会论文集[C];2006年

3 秦余香;全晓艳;;小麦逆境诱导表达及组织特异表达启动子的克隆及鉴定[A];第八届全国小麦基因组学及分子育种大会摘要集[C];2017年

4 马小娟;侯林;陈曦;马飞;;人类选择性剪接基因与选择性启动子关联的系统分析[A];“基因、进化与生理功能多样性”海内外学术研讨会暨中国生理学会第七届比较生理学学术会议论文摘要[C];2009年

5 陈慧峰;林育纯;林丽娜;方飞;陈雯;林忠宁;;蛋白磷酸酶2A不同亚基基因启动子区遗传变异性位点筛查[A];遗传学进步与人口健康高峰论坛论文集[C];2007年

6 陈晓月;金宁一;马海利;贾雷立;刘成宏;陈义锋;;枯草芽孢杆菌启动子基因的克隆及分子进化分析[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第六届理事会第二次会议暨教学专业委员会第六届代表大会论文集[C];2006年

7 邸鹏;陈万生;张磊;;构建“转录因子-启动子”耦联载体开展植物生物碱次生代谢工程[A];中国植物学会七十五周年年会论文摘要汇编（1933-2008）[C];2008年

8 冯俊;刘欣;李光;王义权;;文昌鱼肌动蛋白基因启动子的克隆与鉴定[A];第二届模式生物与人类健康研讨会会议论文集[C];2012年

9 徐蔚晶;严明达;鲁林荣;孙兰英;JacqueTheze;郑仲承;刘新垣;;IL-2诱导表达的TNF-β基因启动子区-130EBS元件的功能研究[A];中国生物化学与分子生物学会第八届会员代表大会暨全国学术会议论文摘要集[C];2001年

10 张扬;张为民;张利红;;双重启动子调节黄鳝脑芳香化酶基因在脑和垂体的特异转录和激素反应性[A];2008年神经内分泌暨神经免疫内分泌学术研讨会论文摘要汇编[C];2008年

相关重要报纸文章 前7条

1 钱铮;人类DNA上启动子数量可能超过19万个[N];医药经济报;2006年

2 记者　钱铮;人类DNA上启动子数量可能超过十九万[N];人民日报;2006年

3 张献怀;辐射诱导启动子能预防造血损伤[N];健康报;2010年

4 ;儿童系统性红斑狼疮中白细胞介素－10启动子区单核苷酸多态性对自身表达水平的影响[N];中国医药报;2003年

5 张中桥;FAS启动子 肿瘤细胞的探测器[N];健康报;2007年

6 张中桥;四医大西京医院发现 FAS启动子具有肿瘤靶向性[N];中国医药报;2007年

7 记者 陈卫东;我破解基因工程产业化难题[N];科技日报;2007年

相关博士学位论文 前10条

1 王轩鹏;油菜小肽基因BnaC.SP6启动子的调控分析及利用[D];华中农业大学;2017年

2 仲威;miR-145启动子区异常高甲基化通过调控CD137信号促进动脉粥样硬化斑块发生[D];江苏大学;2018年

3 刘扬;FHY3参与植物生物钟核心基因CCA1的表达调控研究[D];中国农业科学院;2018年

4 卢超;西洋参两个UDP-葡萄糖基转移酶基因及其启动子的克隆鉴定与功能分析[D];吉林大学;2018年

5 贾向志;人细胞周期相关激酶启动子的克隆和特征研究[D];第四军医大学;2004年

6 周晓红;弓形虫MAG和tSAG1在转基因番茄中的表达研究[D];第一军医大学;2004年

7 侯春晖;红系相关基因的转录调控研究[D];中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）;2004年

8 熊清;真核启动子预测[D];重庆大学;2004年

9 姜安丽;人同源盒基因NKX3.1启动子的克隆及其调控区的鉴定[D];山东大学;2005年

10 杨予涛;一个光合组织特异表达启动子的克隆、功能分析及其转录因子的鉴定[D];山东农业大学;2005年

相关硕士学位论文 前10条

1 省慧;玉米ZmHAK1启动子功能分析及与转录因子ZmRAP2.11和ZmARF2相互作用研究[D];吉林大学;2019年

2 陈夏;镧对LPS激活血管内皮细胞NF-κB-Jmjd3信号轴下游基因表达的表观遗传学调控[D];南昌大学;2016年

3 王亚军;基于热休克蛋白HSP70启动子筛选抗AD中药研究[D];兰州大学;2017年

4 王帆;苹果MdbZIP26基因表达模式及其启动子的功能分析[D];西北农林科技大学;2019年

5 邵宇鹏;大豆GmWRI1a基因启动子克隆及其功能分析[D];东北农业大学;2019年

6 崔文文;花生根特异启动子AhMtan在烟草中的表达分析[D];东北农业大学;2019年

7 徐宜兰;成纤维细胞生长因子19的转录调控机制研究[D];上海交通大学;2017年

8 刁彩凤;miR-101启动子的克隆及其靶基因的确定[D];天津医科大学;2013年

9 王艳艳;干扰素基因刺激因子STING启动子的克隆与初步鉴定[D];南京医科大学;2016年

10 刘明浩;EF1α启动子效率的研究及在EPO表达上的应用[D];吉林大学;2018年

本文编号：2830745