大豆生育期基因TOF7的图位克隆和功能分析

发布时间：2020-09-30 20:11

　　生育期(特别是开花期)是影响大豆品种分布和产量的重要因素之一,大豆生育期调控基因的挖掘和研究,对选育生态适应性广的优良大豆品种至关重要。迄今,诸多调控大豆生育期的E系列基因已被克隆,它们的应用提高了育种效率和产量,但仍未完全解决育种问题。因此,本试验旨在图位克隆新的生育期基因,并进行功能分析,进一步为大豆适应性和产量的提高提供理论依据。具体研究内容如下:1.利用Minsoy(Ele2e3E4)和Archer(elase2E3E4)杂交后构建的MA重组自交系进行长日照条件下开花期QTL检测。通过亲本重测序和MA群体SLAF-seq,共开发了 5,074个分子标记,构建出总长度为3,588.94cM的高密度遗传图谱。结合F6代和F8代MA群体的花期表型,检测到三个稳定遗传的花期QTL(TOF5、TOF6.和和TOF7),分别位于5号、6号和7号染色体上。其中TOF61与E1基因所在基因组位点重合,且E1在本群体中有分离,故TOF6.1可能是E1基因。TOF7对花期贡献率仅次于TOF6.1,其编码基因未见报道。所以,TOF7是一个新花期位点。2.利用MA群体的7号染色体遗传图谱和两年的花期数据,将TOF7粗定位在Chr7:3904858和Chr7:4936114之间,约1.03Mb内,并筛选到该区间的剩余片段杂合系(Residual heterozygous lines,RHLs),#13 和#131。通过对 RHLs#13和#131的花期和生育期鉴定,这2个家系F2后代均呈现出3:1的分离比例,且F3后代均符合1:2:1的分离比,表明TOF7位点由单基因控制。利用TOF7位点的近等基因系(Near-isogenic lines,NILs),NIL-TOF7 植株比 NIL-tof7 的花期和生育期明显提前,说明TOF7基因控制早花早熟。进一步精细定位,TOF7位点缩小到约138kb区间内,并鉴定到TOF7的候选基因为一个拟南芥光周期调控开花途径中关键生物钟基因的同源基因。3.通过基因序列分析,TOF7基因CDS区在亲本间存在非同义碱基差异,且该碱基变异使编码蛋白N端核定信号区的第9位氨基酸发生置换。进而对目的蛋白进行亚细胞定位,亲本Minsoy中TOF7蛋白主要定位于细胞核中;而亲本Archer中tof7蛋白则定位于细胞质和细胞核中。拟南芥功能互补实验显示,亲本Minsoy中的TOF7可回补拟南芥同源基因突变体的早花早熟表型,而亲本Archer中的候选基因则不能。利用CRISPR-cas9基因编辑技术,将TOF7基因碱基缺失突变后,与野生型植株(Wild-Type,WT)相比,长日照条件下突变体明显推迟开花5-6天,生育期延长约15天。这些结果充分证明了 TOF7基因的非同义突变导致蛋白亚细胞定位变化而形成晚花和晚熟。此外,NIL-tof7和突变株tof7分别比NIL-TOF7和WT的单株产量高,这说明TOF7对育种的重要性。4.TOF7基因呈现24h生物钟节律表达,且主要在大豆三重复叶中表达。在大豆光周期调控花期的信号途径中,TOF7基因通过抑制El基因的表达,进而上调GmFT2a和GmFT5a基因的表达,致使开花提前。这些结果将补充大豆生物钟基因调控开花方面的研究。综上所述,本研究是以QTL定位为基础,图位克隆到一个新的、主要的花期调控基因TOF7。通过亚细胞定位、功能互补及突变体等多种方法,证明了TOF7控制早花早熟,并参与到大豆E1-E4构成的生育期调控网络中。本研究将促进大豆光周期调控生育期途径的深入认知,为大豆品种的适应性和分子育种提供有力的理论依据。
【学位单位】：中国科学院大学(中国科学院东北地理与农业生态研究所)
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S565.1;Q943.2
【部分图文】：

生物钟,植物,图位克隆,大豆生育期

逦大豆生育期基因ｒ0ｆ７的图位克隆与功能分析逦逡逑有Ｇ／（Ｇ／Ｇ＾ＭＥＬ４）基因等，详细叙述见下。生物节律的控制基于一种转录和翻译逡逑的负反馈机制，一些蛋白可以拮抗转录因子的活性，进而下调自身的表达（Ｈａｒｍｅｒ逡逑ａｎｄ邋Ｋａｙ，邋２００５）邋0逡逑ｍｏｒｎｉｎｇ逦？ｗａｎｉｎｇ逡逑￣￣￣

大豆,大豆生育期,基因,主要基因

１．２．３．３大豆花期调控网络的初步研究逡逑随着大豆生育期关键基因的克隆及功能的逐步验证，大豆光周期调控生育期逡逑的分子机制也得到进一步的明确，见图１．２。逡逑Ｅ３邋Ｅ４逡逑ｂｉ逦逦（ｔｎ￣邋￡１逡逑！逦Ｊ逡逑NN逡逑个邋ＦＴ２＿邋卜邋＜邋ＦＴ５ａ逦ＦＴ２ａ邋少，ＦＴ５ａ，邋｜逡逑Ｉ逦Ｉ逡逑Ｅａｒｌｙ邋ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ逦Ｌａｔｅ邋ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ逡逑Ｌｏｗ邋ｇｒａｉｎ邋ｙｉｅｌｄ逦Ｈｉｇｈ邋ｇｒａｉｎ邋ｙｉｅｌｄ逡逑ｌ逦ｌ逡逑图１．２大豆开花调控网络逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．２邋Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ邋ｎｅｔｗｏｒｋ邋ｆｏｒ邋ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ邋ｉｎ邋ｓｏｙｂｅａｎ逡逑大豆生育期基因五３和五４基因分别编码光敏色素基因Ｐ／／Ｚ４３和尸／／Ｚ４２，是逡逑控制大豆光周期开花和光周期敏感性的主要基因。五３和五４基因调控大豆开花是逡逑通过诱导五７表达，进而抑制Ｆｒ（ＧｍＦ７２ａ和ＧｍＦｒｋ）的转录，从而抑制开花逡逑（Ｋｏｎｇ等，２０１０）。在短日照条件下，？／基因表达受到光敏色素蛋白Ｅ３和Ｅ４的诱逡逑导调控，？／基因受到五３说的抑制表达。Ｊ蛋白能够与五／基因启动子的ＬＵＸ元逡逑１０逡逑

实验流程,测序,文库

行３＇端加Ａ处理、连接Ｄｕａｌ－ｉｎｄｅｘ测序接头、ＰＣＲ扩增、纯化、混样、切胶选逡逑取目的片段，文库质检合格后用ＩｌｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑ测序平台进行ＰＥ１２５ｂｐ测序。逡逑具体实验流程如图２．１所示：逡逑Ｇｅｎｏｍｅ逦ｓｉｚｅ逦ｓ逡逑？逦ｓｄｅｄｉｏｎ邋三—三{逡逑具逦Ｉ—邋ｃｍ逡逑%煎危剑义希模椋纾澹螅簦椋铮铄义希剑健义希粒簦幔椋欤椋睿珏鍚姡哄危海海驽义希眨梗幔簦铮睢ⅲ咳纾靰0咖＾逡逑？逦＝＾丨４叫ｓ逡逑＞Ｃｌ２Ｚ逡逑图２．１邋ＳＬＡＦ实验流程逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．１邋Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ邋ｐｒｏｔｏｃａｌ邋ｏｆ邋ＳＬＡＦ逡逑２．１．４．３分子标记的开发逡逑ＳＬＡＦ－ｓｅｑ文库的测序原始测序读长为ＰＥ１２５ｂｐ。为保证信息分析质量，在逡逑分析前会对原始测序的数据进行过滤，原始数据过滤标准如下：逡逑（１）

【参考文献】