浓缩生长因子对兔骨膜来源细胞增殖、成骨分化及成血管潜能的研究

发布时间：2020-10-01 14:19

　　目的:近年来,自体骨移植、人工骨替代物等治疗方法已被用于改善、治疗不能自愈骨缺损中~([1,2]),然而,上述方法均存在一定的不足或并发症如疼痛、感染发生和功能紊乱等,阻碍了它们的临床应用~([3]),生物技术和骨组织工程策略已经发展成为在骨缺损治疗中潜在、有效的替代方案~([4])。骨膜来源细胞(Periosteum-derived cells,PDCs)具有很强的增殖活性和成骨分化潜能,对骨折和骨组织缺损的愈合、修复至关重要~([5-7])。PDCs可以修复小鼠骨缺损模型中较大范围的长骨骨缺损;PDCs结合多孔支架能够改善及治疗兔长骨缺损模型,对于增加兔颅骨缺损模型的骨体积有积极作用;PDCs及分离的外泌体能够增强骨髓间充质干细胞(Bone marrow stromal cells,BMSCs)的增殖、迁移和成骨分化;使用PDCs包埋的细胞片包裹BMSCs及磷酸三钙可创建骨膜骨仿生骨移植替代物以增强骨再生;PDCs在种植体周围骨缺损的动物实验中显示出良好的种植体接触范围内骨填充及新骨面积等~([8-13])。新生血管生成、适时的血液供给对移植细胞的存活和骨组织的成功再生具有重要意义,理想的细胞源应具有成骨潜能,同时兼具促血管生成特性~([14,15])。实验研究表明,PDCs可以产生血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)并具有促血管生成的特性~([16]),能够增强内皮细胞增殖、促进缺血条件下的细胞存活并加速血管生成和微血管系统的建立~([17]),此外,与BMSCs相比PDCs含有更多的间充质干细胞~([18])。浓缩生长因子(Concentrated growth factor,CGF)是新一代的血小板浓缩物,制备过程中不需添加任何人工制剂从而避免免疫反应、毒性、交叉污染和伦理等~([19])。CGF中富含多种生长因子:转化生长因子(Transforming growth factor,TGF)、胰岛素样生长因子(Insulin-like growth factor,IGF)、血小板衍生生长因子(Platelet-derived growth factor,PDGF)和VEGF等~([20,21])。骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic protein,BMP)、TGF、PDGF、IGF、核心结合因子α1(Core-bindingfactorα1,Cbfα1)和表皮生长因子(Epidermal growth factor,EGF)等因子在细胞增殖和成骨分化过程中相互作用、调控,单一因子难以获得理想效果~([22])。CGF在口腔软硬组织修复、种植及拔牙位点保存等相关领域中应用较为广泛,许多临床研究表明,CGF可作为生物移植材料应用于上颌窦提升术、提高牙周组织及骨组织修复及即刻种植等并取得良好效果~([23,24])。实验研究显示,CGF可以增加兔颅骨缺损区域骨形成以及多种细胞如根尖乳头干细胞、骨髓间充质干细胞等多种细胞系的分化~([16,25-28]),除此之外,CGF对于施万细胞(Schwann cell)增殖、迁移及神经营养因子的分泌亦具有促进作用~([21])。在本研究中,我们在体外采用组织块培养法与酶消化法分离、提取兔PDCs,对两种方法分离提取的兔PDCs细胞表型采用流式细胞技术鉴定,并对兔PDCs体外成骨、成脂及成软骨诱导分化及相应检测,分析CGF对兔PDCs增殖和成骨分化标志物(碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)、BMP-2、I型胶原(Type 1 collagen,Col-1)、骨钙素(Osteocalcin,OCN)和血管生成标志物VEGF、碱性成纤维生长因子(Basic fibroblast growth factor,bFGF))细胞水平表达及分泌水平的影响,进而为其在骨组织工程等相关领域中的应用提供实验依据。研究方法:1、采用酶消化法与组织块培养法分离提取兔PDCs,倒置显微镜观察两种方法分离提取的兔PDCs的形态学表现。2、采用流式细胞技术检测两种方法分离提取的兔PDCs的细胞表型情况。3、采用CCK-8法检测两种方法分离提取的兔PDCs体外培养的增殖情况。4、分别对兔PDCs进行成骨、成软骨及成脂三系诱导分化及相应指标检测。5、采用CCK-8法检测CGF对兔PDCs增殖情况的影响。6、采用扫描电子显微镜(SEM)分别观察CGF膜及兔PDCs与CGF培养后的超微形态学表现。7、采用碱性磷酸酶(ALP)活性测定法检测CGF对兔PDCs的ALP活性的影响。8、Western blotting方法检测兔PDCs细胞水平成骨分化相关因子(BMP-2、Col-1、OCN)及成血管相关因子(VEGF、bFGF)蛋白的表达情况。9、qRT-PCR方法检测兔PDCs细胞水平成骨分化相关因子BMP-2 mRNA、Col-1mRNA、OCN mRNA及成血管相关因子VEGF mRNA、bFGF mRNA的表达情况。10、ELISA方法检测兔PDCs上清液中成骨分化相关因子(BMP-2、Col-1、OCN)及成血管相关因子(VEGF、bFGF)的分泌情况。结果:1、兔PDCs的形态学表现及变化初期兔PDCs呈不规则或纺锤形,随着培养时间增加逐渐成宽或纺锤形,细胞数量亦显著增加,细胞呈长纺锤形并呈漩涡状生长,酶消化法、组织块培养法分离提取的兔PDCs在各培养阶段的形态学表现相似。2、流式细胞技术检测两种方法分离提取的兔PDCs表型及表面抗原表达情况两种方法获取的兔PDCs细胞表型均为CD34-、CD45-、CD105+及CD166+,组织块培养法与酶消化法获取的兔PDCs细胞表型定量比较差异均无统计学意义(P均0.05)。3、酶消化法、组织块培养法分离提取兔PDCs的增殖情况CCK-8结果显示两种方法分离提取的PDCs在培养第3、5天数量增加较明显,在第7、9天增殖略缓慢,然后可见增殖上升趋势。在各检测时间点,两种方法分离提取的细胞的增殖能力相比差异均无统计学意义(P均0.05)。4、酶消化法、组织块培养法分离提取的兔PDCs进行成骨、成软骨及成脂诱导分化及检测(1)、成骨诱导分化检测结果:诱导第7天茜素红S染色显示PDCs中分布大量大小不等点状橙、橙红色颗粒。OSX、OCN mRNA水平在第7、14天明显上升,两种方法间比较差异无统计学意义(P0.05)。(2)、成软骨诱导分化检测结果:兔PDCs的Col2-a1、Acan mRNA水平在第7、14天均上升,两种方法间比较差异无统计学意义(P0.05)。(3)、成脂诱导分化检测结果:成脂诱导后,兔PDCs胞质内出现透亮、分房状的小脂滴,诱导第7天油红O染色显示有大量红色脂质沉积。Pparg、Fabp4 mRNA水平在第7、14天明显上升,两种方法间比较差异无统计学意义(P0.05)。5、CGF对兔PDCs增殖情况的影响对照组、1×CGF与2×CGF组兔PDCs的增殖能力均随着培养时间延长而有所增加,各组兔PDCs在第3天开始迅速增殖;在第3至21天,1×CGF组、2×CGF组兔PDCs的增殖率明显高于对照组,2×CGF组高于1×CGF组(P0.05)。6、CGF及兔PDCs与CGF培养后的超微形态学表现SEM结果显示在CGF膜中观察到由纤维元素组成的致密多孔三维纤维蛋白网络结构;PDCs与CGF膜培养后可见CGF膜被PDCs覆盖,PDCs具有细长或多边形的形态特征,同时还可观察到多个类似血小板细胞成分在CGF纤维蛋白网络中。7、CGF对兔PDCs成骨分化相关因子ALP活性、(BMP-2、Col-1、OCN)蛋白、mRNA及分泌水平的影响(1)、ALP活性检测结果1×CGF与2×CGF组的ALP水平均呈较明显上升趋势,1×CGF组第21天ALP水平高于第3、7和14天,第14天明显高于第3和7天(P0.05)。与对照组相比,1×CGF、2×CGF组在第3、7、14和21天的ALP活性显著升高;2×CGF组在第7、14和21天均高于1×CGF组(P0.05)。(2)、Western blotting检测结果Western blotting结果显示:1×CGF和2×CGF组的BMP-2、Col-1和OCN相对蛋白水平均明显高于对照组,2×CGF亦高于1×CGF组,各组间比较差异具有统计学意义(P0.05)。(3)、Real Time PCR检测结果qRT-PCR结果显示,与对照组相比,1×CGF与2×CGF组在第3、7、14和21天BMP-2、Col-1、OCN的mRNA表达显著增加,各时间点三组间比较差异均具有统计学意义(P0.05)。(4)、ELISA检测结果ELISA结果显示,CGF膜中BMP-2显示为缓慢释放,在第14天较高随后下降。2×CGF组在各时间点均高于1×CGF组(P0.05);在单纯PDCs对照、PDCs+1×CGF和2×CGF组中,BMP-2、Col-1和OCN分泌水平均呈上升趋势,在相同时间点PDCs+1/2×CGF组的BMP-2、Col-1和OCN分泌水平均高于对照组,差异具有统计学意义(P0.05)。8、CGF对兔PDCs成血管相关因子蛋白、mRNA及分泌水平的影响(1)、CD34和VEGF免疫组织化学检测结果兔PDCs与CGF膜培养后免疫组织化学染色显示PDCs散在生长于CGF膜的表面及纤维蛋白网络内,并在CGF膜的网络中可见散在黄、棕染的CD34阳性细胞;VEGF阳性表达弥漫分布于CGF膜中。(2)、Western blotting检测结果1×CGF和2×CGF组的VEGF、bFGF相对蛋白水平在各时间点均高于对照组(P0.05),2×CGF在各时间点亦高于1×CGF组,各组间比较差异具有统计学意义(P0.05)。(3)、Real Time PCR检测结果1×CGF与2×CGF组在第3、7、14和21天VEGF、bFGF的mRNA表达显著增加,在第3、7、14和21天各CGF组与对照组间比较差异均具有统计学意义(P0.05);2×CGF组VEGF水平在第7、14和21天较1×CGF组高(P0.05),bFGF水平在各时间点均高于1×CGF组(P0.05)。(4)、ELISA检测结果CGF膜中VEGF、bFGF缓慢释放,2×CGF组在各时间点二者浓度均高于1×CGF组(P0.05)。在相同时间点,PDCs+1/2×CGF组的BMP-2、Col-1和OCN分泌水平均高于PDCs对照组(P0.05)。结论:1、采用组织块培养法、酶消化法体外分离、提取均能够获取较高纯度的PDCs,能够为组织工程研究和相关领域的应用提供较为稳定的PDCs细胞来源;同时,兔PDCs的细胞表型及体外三系分化能力,显示了其具备间充质干细胞表型及多系分化潜能的特性。2、CGF膜的三维纤维蛋白网络结构有利于细胞生长、伸展,CGF能够促进兔PDCs的体外增殖,上调ALP活性同时促进BMP-2、Col-1、OCN细胞水平的表达及相关因子的分泌水平,进而促进兔PDCs向成骨分化。3、CGF条件培养基能够促进兔PDCs细胞水平VEGF、bFGF蛋白及mRNA表达,CGF膜纤维蛋白网络中含有CD34阳性细胞同时在培养微环境中上调VEGF、bFGF的分泌水平,为骨组织工程领域-新生血管生成提供了新的思路与途径。
【学位单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R78;R329.2
【部分图文】：

膜分离,股骨,细胞,培养瓶

洗干净后剪成小碎块，置于 10%的 FBS α-MEM 培养基（含 1%青霉素，5% CO2、37℃恒温培养箱培养原代细胞（图 1）。培养液分期分量更换，倒置显微镜下观察 PDCs 融合至约 80%-90%时即养。按 1:3 比例传代培养，吸取旧培养液后用 PBS 轻轻漂洗 1-2 次，然.25%胰蛋白酶室温下消化 2-3 min，倒置显微镜下观察细胞有无突起回缩、细胞间隙增大等进而判断解离程度，适度敲打培养瓶尽量使细胞脱壁即加入适量完全培养基终止消化。弯头吸管有序、力度适中的反复吹打，使全部细胞脱离瓶皿底壁，获得细胞悬液后于 1200 rpm 离心 5 min，后将细胞沉淀用培养液重新悬浮，计数并调整细胞密度得出悬液密度。×104个/mL 浓度接种于 25 cm2培养瓶中，置于 37℃、5％ CO2恒温培养胞贴壁后换液（换液 1 次/2 d），按照 1:3 传代接种在新的培养瓶中继续于倒置显微镜下观察兔 PDCs 的生长情况及形态学变化，注意避免污染 PDCs 用于后续实验。

分离提取,琼脂糖,股骨,恒温培养箱

中国医科大学博士学位论文 α-MEM 培养基（含 1%青霉素/链霉素），置于 37 ℃、5% CO2恒温培养养。以 1×104个/mL 浓度接种于 25 cm2培养瓶中，置于 37℃、5% CO2恒温培养箱内。待细胞贴壁后换液（换液 1 次/2 d），按照 1:3 传代接种养瓶中，置于 5% CO2恒温培养箱中继续培养。每日于倒置显微镜下观s 的生长情况及形态学变化，注意避免污染，第 3 代兔 PDCs 用于后续实

分离提取,形态学,细胞形态,细胞表型

PDCs 形态的观察，发现采用组织块培养法及酶消化法所获取的兔 PDCs 形态变化基本一致（图 3）。图3 组织块培养法与酶消化法分离提取的兔PDCs培养不同阶段的形态学表现（×100，Bar=50μm）注：A-C 为酶消化法细胞形态，D-F 为组织块培养法细胞形态。3.2 兔 PDCs 细胞表型流式细胞仪测定

【相似文献】