lamin基因调控果蝇卵巢生殖干细胞命运的研究

发布时间：2020-10-01 15:29

　　干细胞是一类自我更新和多向分化潜能两种特性的细胞群,这些特征决定了其在医学治疗和器官再生方面具有非常广阔的应用前景。生殖干细胞(Germline Stem Cells,GSC)分裂与分化命运决定方面的研究,已成为干细胞与发育生物学领域关注的热点。自摩尔根发现基因的连锁互换定律以来,果蝇(Drosophila melanogaster)一直作为遗传学和发育生物学研究领域重要的模式生物。因具有可靠的干细胞标记和清晰的发育谱系等优点,果蝇卵巢GSC常被作为生殖干细胞研究的优良模型。核纤层蛋白(Lamin)作为一类中间纤维(Intermediate filament,IF)蛋白为细胞核膜提供骨架支撑,同时还参与染色质组织、DNA复制和损伤修复等过程。我们前期的工作发现,与野生型果蝇(oregon)相比,随着时间的推移,lamin基因突变体果蝇卵巢GSC的数量有降低的趋势。为了确证上述结果,进一步探究lamin调控果蝇卵巢GSC命运的机制,我们利用免疫荧光染色、有丝分裂重组和果蝇转基因等技术,研究了lamin基因调控果蝇卵巢GSC命运的初步机制,本研究成果将贡献于干细胞分裂分化调控领域。首先,以野生型果蝇为对照,利用免疫荧光染色技术统计分析了lamin突变体果蝇卵巢GSC在羽化后不同天数的数量变化情况。果蝇卵巢顶端被称为原卵区,正常原卵区一般含有2-3个GSC。结果显示:野生型果蝇羽化后第1天(1d)和第14天(14d)正常原卵区的比例分别为97.7%和96.4%,两周内卵巢GSC数量基本无变化。lamin四组突变体(lam ~(A25)/lam~(A25)、lam~(A25)/lam~(K2)、lam~(A25)/lam~(04643)和lam ~(K2)/lam~(04643))果蝇在羽化后第1d正常原卵区的比例分别为78.7%、81.8%、84.8%和88.0%;羽化后第14d分别降至27.9%、36.2%、37.6%和48.1%,表明卵巢GSC发生了显著的丢失,且lam~(A25)/lam~(A25)突变体果蝇卵巢GSC丢失最严重。上述结果表明lamin基因是果蝇卵巢GSC维持所必需的。其次,利用UAS/gal4系统对lamin基因分别实施内源性和外源性RNA干扰(RNA interfering,RNAi),统计羽化后不同天数(1d、7d和14d)果蝇卵巢GSC数量变化。在内源性RNAi试验中有两个敲低组,分别为lamin基因2号和3号染色体敲低组。结果显示:对照组(未敲低亲本组)果蝇正常原卵区比例在两周内都高达92.0%以上,表明卵巢GSC数量基本没有变化。羽化后1d、7d和14d,lamin基因2号敲低组正常原卵区比例分别为84.1%、36.7%和31.2%;3号敲低组正常原卵区的比例分别为72.1%、54.8%和36.6%。两组RNAi试验结果显示:随着时间推移,内源性敲低lamin导致正常原卵区的比例明显降低,暗示其卵巢GSC数量发生了严重的下降。当外源性敲低lamin基因,实验组统计结果与对照组无明显变化(P0.05),表明外源性敲低lamin不影响GSC维持。另外,采用有丝分裂重组技术内源性诱导GSC克隆,分别统计1d、7d和14d标记GSC克隆的数量变化。结果显示:野生型对照组标记的GSC(基因型:FRT40A)的百分比在两周内从1d的43.7%下降到14d的42.1%,GSC数量基本无变化。而三个实验组标记的lamin突变(基因型分别为:FRT40A,lam~(A25)、FRT40A,lam~(K2)与FRT40A,lam~(04643))的GSC百分比从第1d的43.8%、45.0%和44.0%下降到第14d的15.1%、16.7%和17.3%,两周内分别有65.5%、62.9%和60.7%的GSC发生了丢失,支持lamin内源性地发挥调控GSC维持的功能。上述结果均暗示lamin基因在调控果蝇卵巢GSC维持方面发挥内源性作用。为了进一步确证lamin基因的功能,排除遗传背景的干扰,本课题构建了一系列lamin转基因载体,分别从内源和外源去挽救lamin基因缺失导致的表型。结果显示:内源性补充lamin基因能完全挽救lamin缺失的表型;仅外源性补充lamin基因无法挽救GSC的数量下降,表明lamin基因仅内源性调控果蝇卵巢GSC的维持。此外,借助免疫组织化学染色技术检测Lamin蛋白的表达模式,观察发现,Lamin蛋白在卵巢GSCs中表达量高,且定位于细胞核膜,暗示了该基因在GSC中发挥重要功能。总之,上述结果充分表明lamin基因发挥内源性调控果蝇卵巢GSC命运的功能。为了确证lamin基因表达与GSC维持的相关性,在RNA水平上,利用荧光定量PCR(qPCR)检测了lamin突变体与RNA干扰品系果蝇卵巢中lamin基因的表达。结果显示,与野生型相比,突变体和RNA干扰组中lamin表达量都有明显降低。在蛋白质水平上,利用蛋白免疫印迹(Western Blot)技术检测Lamin蛋白的表达。结果显示:lamin突变体中Lamin蛋白的表达量显著降低。此结果充分表明lamin基因表达下调是导致果蝇卵巢GSCs丢失的直接原因。再次,借助bamP-GFP报告系统研究lamin与已知BMP/Dpp-bam信号通路的关系。结果显示,对照组中GFP阴性标记的GSC数占97.7%,表明bam基因沉默是GSC维持所必需的。在lamin突变的背景下,三组实验组果蝇(bamP-GFP;lam~(A25)/lam~(A25)、bamP-GFP;lam~(A25)/lam~(K2)和bamP-GFP;lam~(K2)/lam~(04643))卵巢中,分别有18.8%、30.3%和12.5%的GSC中检测到GFP标记的bam的表达,明显高于对照组2.3%比例。该结果表明lamin基因小部分地参与了GSC中bam基因的抑制(位于bam的上游),同时暗示了lamin基因主要位于bam的下游,或通过平行于BMP/Dpp-bam信号通路来抑制GSC的分化以维持干性。既然lamin突变导致GSC数量丢失,那么缺失的GSCs是否走向凋亡?为了回答此问题,利用TUNEL技术对lamin突变果蝇的卵巢GSCs进行凋亡检测。结果显示,野生型果蝇卵巢GSC凋亡发生率为1.8%,两种lamin突变体卵巢GSC凋亡发生率分别为5.1%和5.3%,表明野生型与突变体果蝇的凋亡发生率无明显差异。此外,利用有丝分裂重组技术获得的内源性lamin突变GSC中也没有发现增加的凋亡率。该结果暗示了lamin突变的GSC提前走向分化而导致丢失。我们的工作加深了对GSC命运决定机制的理解。
【学位单位】：安徽师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q25
【部分图文】：

果蝇,生活史,雌雄,诱变技术

学资源（果蝇库）种类丰富，遗传分析手段相对成熟个果蝇库：东京库、美国库和维也纳库，保存有各种、RNAi 等，其对研究 GSC 的自我更新、增殖和分化方用的技术有：转基因技术、基因编辑技术、基因敲除因诱变技术、RNA 干扰技术等。的全基因组已经完全释放，基因序列高度保守，在进哺乳动物有极相似之处，可用于功能性研究。

模式图,果蝇,卵巢,模式图

终发育为成熟的卵细胞排出体外，另外 15 个细胞则形成多倍体的滋养细胞（Nurse Cells）[10]，在大多数卵子形成过程中，卵母细胞生长和发育所需的营养物质均有滋养细胞通过环管运输[27]。卵巢中不同的细胞类型可通过其特有的分子标记、形态特征和解剖位置加以区别。GSC 在卵巢中很容易被识别，在与 CpC 直接接触的位置具有特征性融合蛋白“fusome”[28]作为分子标记，fusome 在 GSC 中呈圆球形且位于 GSC 前端，而在 GSC 分化的 CB 中，fusome 呈圆球形定位于 CB 的后端，随着 CB 分化为生殖系包囊，fusome 成长为分支状的膜骨架结合蛋白“spectrosome”，主要标记分化的包囊（cysts）。Fusome 和 spectrosome 均为生殖细胞特异性细胞器，富含大量的膜骨架蛋白，如 Hts 细胞骨架蛋白[28; 29]，可使用抗 Hts 抗体标记定位生殖细胞，主要与有丝分裂纺锤体的一极有关[30]，且与生殖系囊肿的形成和卵母细胞的分化关系密切[31]。

信号通路,果蝇,卵巢

导致 GSC 缺失的表型[69]。bam 基因作为 BMP/Dpp基因，位于 BMP 信号通路的下游，bam 是 GSC 不对的关键因子，对果蝇卵巢 GSC 的维持至关重要。正常的子代细胞 CB 的合成量高于 GSC[79]，主要作为关键CB 的分化[81]，但在 Bam 蛋白缺失的情况下，会抑制生殖系肿瘤。BMP-Dpp 信号通路的主要靶点是对 b够负反馈调节 bam 在 GSC 的表达水平[80]，维持 GS信号的情况下，Bam蛋白水平在过度增殖的生殖细胞中MP-Dpp 信号通路还具有逆分化的功能，可将 GSC 分能性的 GSC[87]。

【相似文献】